发布时间:2023-11-20 09:56:42
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作者简介:陈婷(1990-),女,湖北人,硕士,研究方向:术后认知功能障碍的动物模型行为学研究。作者简介:张宗泽
光遗传学被《Naturemethods》评为2010年度生物技术[1]。光遗传学技术是将光学和遗传学技术相结合,利用病毒载体,将微生物视蛋白基因引入到载体动物的脑组织,采用不同波长和频率的光进行照射,通过刺激光敏感蛋白开启或关闭特定细胞类群或特定神经元的活动进而调控其功能,从而控制动物行为[2]。本文就光遗传学技术的基本方法及应用,以及其在神经-精神疾病动物模型中如何调控神经回路作一综述。
一、光遗传学技术
近来,研究者一直致力于不同行为的神经回路研究,探讨其投射连接,观察通过调控某一类神经元活动后的相应行为学表现。而电刺激和药理学的方法可能导致实验结果不准确,光遗传学技术具有目的性强、低损伤性、高时空分辨率和遗传特异性等特点,近年来在神经科学领域的生物学机制的研究中得到了广泛应用。光遗传学技术可包括下述几部分,对此作简单介绍。
1光敏感蛋白
生物体内存在着一类可以感受不同波长光的刺激,并对该光学刺激产生一系列效应的膜蛋白,即视蛋白。
目前,Ⅰ型视蛋白包括:细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,BR),盐视紫红质(Halorhodopsin,HR),通道视紫红质(Channelrhodopsin,ChR)。ChR在莱茵衣藻(Chlammydomonasreinhardti)中发现,为蓝光激活的阳离子通道蛋白,作用为阳离子内流,使细胞膜去极化。2005年,ChR2首次应用于光控制神经元活动的实验中。Ⅱ型视蛋白OptoXR,为视紫红质G蛋白偶联受体的嵌合体。是一种光敏感与G蛋白偶联的膜受体,G蛋白又称鸟苷酸结合蛋白,与G蛋白偶联的膜受体有很多种,如M胆碱能受体、多巴胺能受体等,可参与细胞内信号转导,还可调控如谷氨酸等神经递质的信号传递功能[3]。
2光敏感蛋白的表达
光敏感蛋白,是光遗传学的一种关键工具,在脑内诸多神经元中稳定表达。随着生物工程技术的发展,现在已经研发出许多将光敏感基因运载至细胞或神经元,并有效表达成光敏感蛋白的病毒载体。如腺相关病毒AVV、慢病毒、Cre-Loxp重组酶系统和各种转基因小鼠等。
3光刺激和信号记录
光刺激系统有光列二极管(LED)等。体外实验中,脑片电生理-全细胞膜片钳技术记录神经元放电信号,观察其光电流特征;在体实验中,在体立体定向注射病毒载体,经过10-14天待其充分表达后,构建光神经界面,植入光纤并固定,行在体光刺激,细胞膜内外离子差产生,膜电位发生变化,记录神经元的放电情况[4]。与光调控相匹配的解读体系包括电生理记录,功能磁共振成像或定量的动物行为学分析等。
二、光遗传学技术在神经科学研究中的应用
通过光遗传学技术可将光敏感通道蛋白表达在特定的细胞,用于突触可塑性、神经系统的疾病治疗、动物行为学、神经回路研究等多方面。
1突触可塑性的研究
树突棘是大脑神经元接受和传递信息的重要结构,是形成突触的关键部位,在突触可塑性中发挥重要作用。90%以上的兴奋性突触存在于树突棘头部中,应用光遗传学技术可以同时检测多个树突棘的信号,突破了停留在单个突触水平的研究。Takahashi等[5]通过对啮齿类动物海马区锥体细胞的上百个树突棘进行研究,发现临近的树突棘在自发活动中会趋于同步化,使得输入信号整合,成为动作电位输出。
也有研究应用光照激活星型胶质细胞上表达的ChR2能促发谷氨酸递质释放,可激活神经元的AMPA受体[6],而AMPA受体与突触可塑性有关。这些研究表明通过选择性调节特异性神经元或神经细胞数量,光遗传学技术在突触可塑性研究中有较大应用前景。
2神经系统疾病的治疗研究
光遗传学技术除了检测大脑中癫痫发作的起始点外,还用于研究严重癫痫持续状态的持续或中止[7]。Sukhotinsky等[8]利用光遗传学技术揭示了海马兴奋型神经元在氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠急性癫痫中的作用。
Alilain等[9]利用光遗传学技术将ChR2表达于膈肌运动细胞群,光照刺激下,颈部脊髓损伤的动物可以恢复呼吸运动。光遗传学技术也为帕金森症的神经机制提供了新的见解和思路。
3动物行为学和神经回路研究
动物交际行为学测试中,通过光遗传学技术可明确下丘脑泌素/进食素在特定情境中扮演的角色[10]。Huber等[11]利用光遗传学技术将ChR2表达在小鼠初级感觉皮层-桶状皮层神经元中,利用蓝光照射并结合奖励进行行为学训练的方式,蓝光照射时,小鼠向左转,给予水喝,作为正确识别的奖励,研究小鼠行为与光照之间的关系,证实小鼠奖赏记忆行为准确率与蓝光照射有较强的相关性。
神经回路是神经细胞、分子活动和脑整体活动的连接桥梁。运用光遗传学技术,在动物中实现了对神经元和突触的高时间分辨率、高精确度的光学调控,为动物行为学的神经回路的研究提供较好的一个方法学技术。
三、光遗传学技术在动物行为学中的应用研究
光遗传学技术在动物行为学应用中有良好前景,尤其适用于探索特定类型神经元活动范式与动物行为改变之间因果关系的研究。光遗传学技术在动物交际行为、恐惧记忆行为、奖赏记忆行为、焦虑样行为等行为学的神经回路进行深入研究,不仅可以记录活体动物的脑整体活动,也可记录拟研究神经回路活动的细胞、分子的活动表现,是研究动物行为学的神经回路的一个重要事件,推动了神经回路研究的进步。
然而,涉及神经回路和脑功能的研究,不能直接在人体上进行,动物模型成了重要选择。能否在动物身上建立精神性疾病模型存在争议。例如,精神性疾病的一些诊断特点,如悲伤,内疚,妄想和思维混乱,这些症状在动物模型中难以确定[12]。目前,已成功建立了能概括精神性疾病重要特征,如恐惧记忆、焦虑症、抑郁症等动物模型。同时,应用光遗传学阐明啮齿动物模型中有关精神疾病许多复杂行为的相关神经通路。
1焦虑-社交障碍症候群动物行为学
根据临床资料,焦虑症和社交功能障碍之间有着显著的联系,这种联系可能为理解焦虑症和社交障碍的共同神经通路提供线索。抗焦虑药物可减少当动物被放置在易焦虑环境中的社交受损[13]。不同的自闭症小鼠模型均表现出明显的社交功能障碍以及增强的焦虑样行为[14]。这些研究均表明,焦虑症和社交功能是紧密联系的,并且可能存在一个共同的病理神经机制。
2焦虑样行为的动物行为学
焦虑鼠模型的光遗传学研究,发现特定的杏仁核突触,可快速可逆地调制焦虑水平。Tye等[15]研究发现,利用ChR2成功表达后,进行光照射,可以通过激活基底外侧杏仁核(BasolateralAmygdala,BLA)到中央杏仁核(CentralAmygdala,CeA)的突触投射,小鼠的开臂时间增多,表明产生去焦虑样行为;利用eNpHR3.0成功表达后,进行光照射,可以通过抑制突触连接,小鼠在高架十字迷宫的开臂时间减少,小鼠表现为焦虑样行为。
为了研究基底外侧杏仁核-腹侧海马(vHPC)通路,研究者[16]将感光视蛋白表达于BLA谷氨酸能神经元且视觉纤维被定位在BLA轴突终止的vHPC内,光刺激BLA中止于vHPC的胆碱能神经元诱发的焦虑样效应被vHPC的谷氨酸能神经元抑制,证实兴奋BLA-vHPC神经通路可增加焦虑,抑制BLA-vHPC的轴突将减少焦虑鼠模型中焦虑相关行为。此研究确定了BLA-vHPC为一个双向控制焦虑相关行为的神经通路。
3基底外侧杏仁核-腹侧海马(BLA-vHPC)神经回路的阐明
摘 要:由肺阳虚证的概况及其动物模型的理论为基础,本文将从肺阳虚证的研究进展以及中药对肺阳虚作用的研究进展详加阐述。
关键词:肺阳虚;动物模型; 中药复方
肺居胸腔,在脏腑中,其位最高,故称“华盖”。其主要生理功能有主气而司呼吸,主宣发和肃降,通调水道,朝百脉、主治节。肺阳与五脏关系密切,肺阳虚势必涉及五脏。而五脏久病必累及肺,可见肺是人体各脏器的调节中心。
目前国内外关于肺虚证本质和肺虚证定位的现代医学研究报道日益增多,现代中医学引进了临床实验和动物实验两大类方法。现行的动物模型大多为病理型模型与病因型模型。病因型模型强调模拟临床病证形成的原因,将引起相应证候的病因施加在动物身上力求造成的模型和病人的临床主要表现一致,突出中医理论的指导作用,能较好地体现“从证测因”。利用临床上已取得的肺阳虚证病理研究成果作为依据,将能够造成该种证候特异性病理改变的因素(如物理因素、化学因素、生物因素等)作用于实验动物,即可造成病理模型。
多数研究者认为,肺阳虚临床表现概括起来为肺气虚与寒象或阳虚共见.
[中图分类号] R282.71 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2013)08(a)-0004-03
大黄药理作用广泛,《神农本草经》载:“大黄,荡涤肠胃,推陈致新,通利水谷,调中化食,安和五脏[1-5]。”现代药理研究表明其具有抗感染、抗病毒、抗肿瘤、治疗糖尿病等作用,既可内服,亦可外用,在临床上可大量使用[6-12]。据统计,全国8000多种中药制剂中有800多种含有大黄,大多数降脂减肥、排毒养颜类中成药均含有大黄[13]。目前对大黄长期服用的有关毒理学方面报道较少,为探讨其安全性,本项目进行了大黄颗粒长期毒性试验研究。
1 材料与方法
1.1 受试药物
大黄颗粒,由天津现代医药开发研究所提供。
1.2 试验动物
Wistar种大鼠(SPF级),雌雄各半,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.3 试验试剂
1.3.1 生化试剂 尿素氮(BUN)试剂盒、血糖(PG)、丙氨酸肌酐(CREA)等,上海丰汇医学科技有限公司生产。
1.3.2 目测八联试纸带(OCTO TEST PAPER) 广州花都高尔宝生物技术有限公司生产。
1.4 试验仪器
F-820血细胞计数仪、BECKMAN CX4 COULTERTM PRO全自动生化分析仪。
1.5 试验方法
Wistar大鼠,体重85~105 g,按体重随机分为高、中、低3个剂量组及对照组,3个剂量组的给药剂量分别为10、5、2.5 g/kg(生药),分别相当于人用临床剂量(0.1 g/kg)的100、50、25倍。每组30只动物,雌雄各半。每日定时灌胃给药1次,每周给药6 d,连续给药26周,给药体积为10 ml/kg;对照组给予等体积纯化水,给药时观察动物的一般状态,每周测体重1次。26周末给药后(每组雌雄各10只)及停药4周后(每组雌雄各5只)动物禁食24 h,用目测八联试纸法测定尿液。股动脉取血进行血常规、血生化及电解质检查。各组动物分别剖取脑、心、肝、肾、脾等脏器称重并计算脏器系数,制成HE染色切片,进行组织学检查。
1.6 统计学方法
应用SPSS 13.0软件处理数据,计量资料采用t检验,计数资料采用χ2检验,以P
2 结果
2.1 一般状况
给药期间,供试品高剂量组大鼠精神萎靡,排稀便,被毛晦暗,中、低剂量组动物被毛光泽,眼、鼻、耳、口、生殖器无异常分泌物,大小便正常,未见有系统毒性症状出现。停药恢复期间,高剂量组大鼠状态逐步恢复。
2.2 各组体重及摄食量的比较
给药26周,与对照组比较,高剂量组雌、雄动物体重增长缓慢,摄食量减少(表1)。
2.3 各组尿常规的比较
给药26周,高剂量组雌、雄大鼠尿蛋白阳性动物例数增多,其余各指标与对照相比差异无统计学意义(表2)。
2.4 各组血常规、血生化及电解质检查的比较
各剂量组各项血液学指标与对照组比较差异均无统计学意义;高剂量组动物GLU、Cl-较对照升高,余指标差异无统计学意义,中、低剂量组与对照组相比差异无统计学意义(表3)。
2.5 各组脏器重量及脏器系数的比较
各剂量组脏器重量及脏器系数与对照组比较差异无统计学意义(表4、5)。
2.6 病理组织学观察
各剂量组动物解剖后见胸、腹腔未见出血点及积液,主要脏器大体观察未见明显病变。组织学检查除高剂量组雌、雄动物均可见肾小管上皮细胞肿胀外,其余脏器未见与药物相关的病理变化。
3 讨论
大黄,大苦大寒,有泻热通腑、荡涤肠胃之功,临床常用于大便不通、积滞泻痢、里急后重及溏而不爽等症[14-15],是临床常用的传统中药。大黄颗粒是利用现代工艺技术开发的一种具有泻下攻积、凉血解毒、清热泻火、利湿退黄、逐瘀通经等功效的中药冲剂,使用广泛,对其长期服用的毒性反应、安全剂量等,国内外少有报道,缺乏长期大剂量服用的安全性评估数据,本研究对大黄颗粒进行了较为完整的长期毒性评价。
本试验研究结果表明,长期给予高剂量大黄颗粒的雌、雄动物均被毛晦暗、排稀便、体重增长缓慢,考虑是大黄具有导泻作用造成动物腹泻,从而影响食物中营养成分的吸收所致。本实验提示大黄颗粒高剂量对动物无致死作用,但腹泻导致营养成分的流失而明显延缓了动物生长发育;高剂量组尿蛋白阳性数明显增多,且病理组织学检查发现动物肾小管上皮细胞肿胀,提示长期服用大剂量大黄具有一定的肾毒性,应密切监测肾功能;高剂量组血Cl-升高,表明其可能对电解质的分泌和吸收有影响;高剂量动物血糖轻度升高,考虑是大黄含有多糖成分,长期给药导致血糖升高,临床应监测血糖水平,尤其对糖尿病患者。试验期间中、低剂量组动物状态良好,被毛光泽,生长正常,体重增加,大小便颜色形状均未见异常,口、鼻、生殖器等未见异常分泌物,未见毒性反应及死亡,表明大黄颗粒中、低剂量对动物的生长发育无明显不良影响,无致死作用;尿常规、血常规、血生化、脏器重量及脏器系数检查,中、低剂量组与对照组相比均无差异,且动物解剖后胸腔、腹腔浆膜光滑,未见出血点及积液,心、肝、脾、肺、肾等主要脏器位置正常,大体观察未见明显病变,开颅后脑膜及脑未见异常,病理组织学检查各脏器未见明显病理变化,表明中、低剂量对动物的神经、泌尿、心血管等系统无明显的毒性作用。上述研究结果表明只要大黄颗粒给予剂量合理,长期服用即安全。
综上所述,大黄颗粒以剂量≤5 g/kg(相当于临床人用剂量的100倍)对大鼠长期灌胃,未见明显毒性反应,安全范围广。随着研究手段的进步,人们对大黄的认识会日趋深入。
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16.重编程及诱导性多能干细胞在再生医学的研究进展刘路,韦曦,凌均棨
17.特异因子在牙源性角化囊性瘤中的表达及其影响黄珞,廖贵清
1.角朊细胞在口腔黏膜免疫反应中的作用程斌,吴桐,贾丽华,CHENGBin,WUTong,JIALi-hua
2.大鼠舌黏膜癌变中黏着斑激酶的转录表达及其与细胞凋亡的关系研究夏娟,律娜,陶小安,洪筠,陈小华,戴耀晖,程斌,XIAJuan,LVNa,TAOXiao-an,HONGYun,CHENXiao-hua,DAIYao-hui,CHENGBin
3.热休克蛋白27在舌白斑中的表达及意义盛士虎,张宁宁,黎炽彬,陈丹,燕王翔,丁学强,王安训,SHENGShi-hu,ZHANGNing-ning,LIZhi-bin,CHENDan,YANWang-xiang,DINGXue-qiang,WANGAn-xun
4.非贵金属烤瓷冠修复患者龈沟液中白细胞介素-1β及天门冬氨酸转氨酶水平研究赵彤,彭诚,ZHAOTong,PENGCheng
5.下颌第二磨牙半切术后固定修复的三维有限元分析杜发亮,陈霞云,聂二民,黄颖荷,张春元,DUFa-liang,CHENXia-yun,NIEEr-min,HUANGYing-he,ZHANGChun-yuan
6.纳米填料复合树脂抛光后表面粗糙度及微结构的比较王南燕,欧阳勇,WANGNan-yan,OU-YANGYong
7.正畸力作用下龈沟液中氧自由基的变化研究李朝晖,徐盛,刘远林,LIZhao-hui,XUSheng,LIUYuan-lin
8.中华口腔医学研究杂志(电子版) 镍铬烤瓷冠修复患者尿镍铬水平调查研究徐碧瑶,王学才,宋建根,王法弟,夏刚,吴强松,王奥琳,姜庆五,陈波
9.C型先锋锉和乙二胺四乙酸分次疏通磨牙弯曲钙化根管的临床研究蔡华雄,程慧琳,宋洁文,陈素雅,CAIHua-xiong,CHENGHui-ling,SONGJie-wen,CHENSu-ya
10.吸烟和非吸烟慢性牙周炎患者基础治疗后龈沟液肝细胞生长因子水平的变化陈建洪,吴坚,李亚静,唐倩,梁焕友,CHENJian-hong,WUJian,LIYa-jing,TANGQian,LIANGHuan-you
11.舌鳞癌红细胞生成素及其受体的表达和临床意义武东辉,李劲松,李海刚,林钊宇,陈伟良,潘朝斌,WUDong-hui,LIJin-song,LIHai-gang,LINZhao-yu,CHENWei-liang,PANChao-bin
12.磁力Twin-block矫治器治疗安氏Ⅱ类Ⅰ分类错(牙合)后颌骨及颞下颌关节变化的研究李业荣,陈月明,许碧晖,招顺秀,LIYe-rong,ZHENYue-ming,XUBi-hui,ZHAOShun-xiu
预防兽医学研究生由于对本学科研究领域的基础理论和技术研究及应用认识不充分,他们的研究很大一部分重复国内外最新研究,表现为对国内国际最新研究进展的跟踪性研究很多,①因此预防兽医学研究生研究内容过分集中和单一,很难有创新和突破。国家自然科学基金委项目管理专家们指出:今后预防兽医学研究选题应把预防兽医领域经典的病毒学、细菌学、免疫学和病理学等基础理论同动物实验技术和现代分子生物学技术结合,才能进一步扩展该领域研究的广度和深度,才能最终把病原落实到易感宿主动物,把病原和构成病的易感宿主动物体结合起来,这样才能阐明病原的致病机理,在弄清病原致病机理的基础上,才能研究和开发有效的防制产品,制定恰当的防制措施,减少动物传染病所带来的损失。
预防兽医学研究选题还应立足于当前我国畜牧生产的需求,在今后一段时期内,重视研究畜(禽)群中宿主动物的易感性、病原对不同易感宿主的感染规律,研究病原生态学,阐明病原与宿主的相互作用机制,不同病原在畜(禽)群中的共同存在以及不同病原间的相互作用,在这些相互作用的过程中,病原的变异及重组等对其毒力和致病性的影响等,②这样不仅能把新技术更好地加以运用,同时也能解决我国畜牧生产中亟待解决的预防兽医学问题。预防兽医学研究生导师和研究生应结合国家科技管理政策导向和我国畜牧业生产的实际需求,在研究大方向确定的前提下,合理定位细致的研究方向,开展创新性研究。
2 现代分子生物学技术应作为预防兽医学研究生重要的专业基础课
自20世纪以来,生命科学领域的每一点进步都离不开分子生物学理论和技术的进步,分子生物学在预防兽医学的病原学、免疫学和疫病预防与控制学研究等方面都也起着重要的作用。预防兽医学分子生物学形成和发展以及与预防兽医学其它学科如微生物学和免疫学等的相互融合、相互促进的过程,在整个分子生物学的发展历史中扮演重要的角色。预防兽医学分子生物学技术是分子生物学的重要组成部分,它的形成和发展对其它学科特别是分子生物学本身也具有巨大的推动作用。同时分子生物学的快速发展,为预防兽医学在分子水平阐明疾病病原的生物特征、发病规律、致病机理以及采取有效手段进行预防和控制疾病提供了理论和方法。③因此,作为预防兽医学的研究生,广泛学习分子生物学理论与技术,对提高其研究水平和拓宽其研究领域具有重要作用。在预防兽医学研究生课程设置中,应开设分子生物学理论与技术作为重要的专业基础课程,同时应将其与其他课程密切联系起来。
3 教师在研究生科研能力培养过程中起着主导作用
培养研究生科研能力的教师,不单单是研究生的导师,它还包括了不直接承担指导研究生研究任务只从事研究生课程教学的教师。研究生科研能力的提高离不开教学和指导,教师培养研究生的科研能力是责任,国内外研究生教育的共同做法是导师作为主导指导研究生在其他教师的课堂或实践教学下,完成基础理论和基本技能的学习,在导师指导下独立选题或完成导师承担的课题,不管是独立自主选题还是完成导师的研究课题,都需要研究生以课题为载体,完成课题的理论或实验研究,发表相应的研究论文。
研究生科研能力的培养和提高,虽然是一个非常复杂而且漫长的过程,但在教师有目的、有计划的指导和培养下,以研究生本人在长期学习和训练中掌握的基础知识、基本理论和基本技能为基础,研究生的科研能力是完全可以获得和不断提高的。从总体上讲,取得了很好的成绩。但还存在诸多问题,如课程教学令人堪忧、导师指导不尽人意、学生素质下降和学位论文质量控制不严等,严重影响了教师培养研究生科研能力。究其原因主要是由于国家教育资源的紧缺、教育政策和社会经济发展不平衡等的不利影响,研究生教育从精品化向大众化方向发展,学生素质难免良莠不齐,再加上学校对教师和研究生的管理的松懈,教师和研究生都没有充分重视自己的职责,教师没有严把教学质量关和研究生论文质量,学生停留于应付论文,甚至出现大量的论文抄袭现象等,同时研究生和教师的自身素质亟待提高。与国内教师比较,国外教师在培养研究生科研能力方面的做法值得提倡,他们在研究生生源上严格把关,研究生入学后,在课程教学和导师指导上充分发挥培养研究生科研能力的作用,并通过不断探索和完善导师指导方式,促进对研究生科研能力的培养。④在预防兽医学研究生培养的过程中,要培养研究生的科研能力,兽医学是一门实践性很强的学科,要不断加强对预防兽医学研究生动手能力和接触生产实践环节的培养,在实践中积累大量的一手研究材料,从实践中来,再回到实践中去。
4 实验室是预防兽医学专业研究生培养必要的硬件支撑
随着规模化养殖的发展,疫病的群防群治越来越重要,特别是对经济动物来说,预防兽医学对经济动物养殖业的发展更是起着保驾护航的作用。兽医学实验室特别是预防兽医学实验室是动物疫病防控体系的重要组成部分,是农业院校培养兽医人才的重要基地,同时也是从事兽医科学研究和培养研究人才的基础。⑤加强预防兽医学实验室建设和管理是实现“预防为主”动物疫病防控方针的基础。预防兽医学实验室应合理规划布局,将实验室分为不同的功能区域,比如准备室、病毒室、细菌室、血清学实验室、分子生物学实验室、细胞培养室以及学生教室等功能间。只有实验室功能分区恰当,合理布局,按标准配置实验仪器,这样才能为预防兽医学专业研究生培养提供必要的硬件支持。
综述所述,通过对预防兽医学专业研究方向、课程设置中分子生物学技术在预防兽医学研究中的作用、教师在培养研究生中的作用和预防兽医学实验室建设等软、硬件方面进行的分析,阐明了这些因素对预防兽医学专业研究生培养的影响和其重要作用,为培养具有创新能力、动手能力和适应能力的专业型预防兽医研究人才提出如下建议:准确把握预防兽医学研究生培养方向,并为研究生研究课题的完成提供良好的实验条件,导师作为主导,充分发挥其在培养研究生过程中的指导和引领作用。这样才能不断提高预防兽医学研究生的培养质量。
注释
①②陈越,于振良,杜生明.预防兽医学资助格局及未来研究方向的探讨[J].中国基础科学:58-61.