生物细胞的作用范文

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篇1

0引言

骨骼损伤、肿瘤等导致的骨缺损是骨科每天都要面临的问题，临床医生通常是通过自体或异体骨移植方法来解决缺损问题，但这种方法存在着来源有限、增加创伤、排斥反应及疾病传播等问题. 由于利用组织工程学原理与方法再生的骨组织植入体内无免疫排斥的危险且来源充足，因此它的优势逐渐得到认同［1］ . 近年来，组织工程迅猛发展并且是目前公认的最有可能在临床取得实际效益的研究领域之一［2］. 但是要真正广泛应用于临床，还必须解决好组织工程的三大关键问题即种子细胞、可降解的生物支架及生长因子. 骨髓来源的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells， MSCs)由于取材容易，易于体外培养和诱导，是目前最有前途成为组织工程种子细胞来源的细胞［3-4］. 组织工程是将细胞与材料复合，从而构建植入人体的活材料. 在此过程中，目的细胞的生长调控是十分重要的一环，因此对生长因子的作用及其机制的研究是组织工程的重要内容. 生长因子是通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多肽因子，它对细胞具有促进或抑制其分裂增殖、迁移和基因表达的作用. 生长因子对目的细胞作用有利于在体外构建与体内更为相似的模拟环境，从而为体内试验奠定基础.

1骨髓基质干细胞及成骨诱导

目前，骨组织工程种子细胞的分离主要有三种来源：骨髓来源、骨膜来源和松质骨来源［5］. 种子细胞的培养是骨组织工程的前提与基础. MSCs 由于其强大的增殖能力与多向分化潜能成为骨组织工程的种子细胞之一［6］.

骨髓是由造血系统和基质系统组成的复合组织，它除了是造血干细胞的主要来源外，同时成人的骨髓组织中还存在着骨髓间质干细胞. 20世纪70年代中期，Friedenstein等［7］报道，骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落，这部分贴壁的细胞就是骨髓基质干细胞，也叫间质干细胞. 这种间质干细胞具有多方向的分化潜能，可以分化成为骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等组织［8-9］. 间质干细胞的多向分化特性使之成为组织工程的理想细胞来源，是目前骨组织工程普遍选用的细胞. 近年来的许多组织工程研究均采用了人或动物的骨髓间质干细胞，其结果十分令人满意［10-11］.

现有的MSCs培养方法主要为应用诱导剂 (地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸) 和生长因子进行诱导，但诱导效果均不甚理想. 国内外研究者发现， MSCs的分化具有位点特异性，即在何种微环境中培养MSCs，就倾向于向这类环境中的细胞分化. 根据MSCs分化的位点特异性，在骨组织工程中欲把MSCs诱导分化为成骨细胞，采用模拟成骨微环境来诱导MSCs的增殖与成骨分化可能也是一种有效的诱导方法［12-13］.

2骨组织工程相关因子

生长因子的合理应用对构建骨组织工程起着关键的作用. 骨组织拥有一个庞大的生长因子库，目前在骨组织中发现了十几种生长因子，已经发现有多种细胞因子对成骨过程具有重要的调节作用，可以诱导成骨、促进细胞增殖和胶原合成、促进成骨和血管生长以及在骨吸收改建方面发挥作用，因此在构建组织工程骨时对成骨因子合理使用或调控成骨细胞的适时适量表达十分重要.

2.1血管内皮生长因子VEGF又称血管通透因子(VPF)或（VAS），是近年来发现的一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对胚胎发育及切口修复等生理功能有重要意义. VEGF是一种糖蛋白，其相对分子量为34~45 ku由两个相对分子量各为17 ~22 ku的不同亚单位组成的二聚体，VEGF就是由于该基因的剪切方式不同所形成的系列产物. 人至少有4种VEGF，分别为VEGF121， VEGF165， VEGF189和VEGF206. 近年来研究表明，血管内皮生长因子对中胚层细胞分化有作用，可以使骨髓基质干细胞向成骨分化. Midy等［14］发现，外源性VEGF能使体外培养的成骨细胞碱性磷酸酶(ALP) 活性及cAMP浓度提高4倍. VEGF诱导成骨细胞迁移，增加ALP活性，同时成骨细胞自身合成VEGF. PGE1， PGE2， 1， 25(OH)维生素D3及IGFⅠ能增加成骨细胞VEGF mRNA的表达.

2.2肿瘤坏死因子TNF是一种糖蛋白的低聚物，分子量为39~70 ku，是多功能的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和T细胞产生. TNF是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤细胞作用最强的生物活性因子之一. TNF分两大类：由活化的巨噬细胞产生的称为TNFα，由活化的T细胞产生的TNF称为TNFβ，它们共同作用于同一受体. TNF可刺激培养的成骨细胞和骨器官合成RNA和PGE2，TNF可以抑制胶原和骨钙素的合成以及1， 25(OH)维生素D3刺激的ALP活性，但它可刺激Ι型胶原mRNA表达，这说明TNF的这种胶原合成抑制作用受翻译后产物的调节［15］.

2.3骨形成蛋白BMP是广泛存在于骨基质中的一种酸性糖蛋白，是目前唯一被确认具有异位成骨能力的生长因子，它能在体内、外诱导骨髓基质细胞转化为成骨细胞，使高分化的骨细胞群体数量保持稳定. Okubo等［16］用支架材料与不同剂量的BMP复合后植入兔下颌骨的骨缺损中，3 wk后ALP和组织学检查发现新骨形成，证实BMP诱导成骨系软骨内化骨形成过程，且成骨量随BMP剂量增加而增加，有明显的剂量依赖性. 陈克明等［17］认为： BMP与纤维蛋白制成的复合物，具有良好的骨诱导活性. 载体包容BMP等诱导因子可有效缓慢的释放，以发挥其诱导作用. 余家阔等［18］认为，在BMP诱导下，无论是幼稚软骨细胞还是成熟软骨细胞都有表达成骨细胞表型的趋势. 目前认为BMP是骨组织工程中促进成骨作用最重要的一种，近年来BMP作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视，然而其诱导成骨的机制目前却并不完全清楚. 但由于BMP在骨组织中含量极少且在体内扩散很快，容易被蛋白酶所分解，因而不能在局部发挥持续刺激和诱导成骨作用，其诱导活性难以得到充分的发挥［19］.

2.4转移生长因子TGFβ是一种有多种功能的单链多肽，分子量为25ku，具有对骨组织、结缔组织及免疫系统等细胞的调节功能，其调节作用包括细胞生长调节和分化诱导两方面. 目前发现有5种亚型，分别为TGFβ1~TGFβ5. TGFβ广泛存在于多种组织及转化细胞中，其中以骨组织、血小板、软骨组织中含量最丰富，而TGFβ受体在成骨细胞表达最多，表明TGFβ的主要作用是调节骨代谢. 有实验表明TGFβ对胶原基因表达和胶原的合成具有促进作用. TGFβ可促进细胞增殖与分化，促进细胞外基质合成，也是多种免疫细胞的自分泌或旁分泌的调节因子［20］.

TGFβ为主要成骨因子之一，它诱导间充质细胞合成软骨特异性蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，刺激成骨细胞的增殖及胶原合成. TGFβ在体外对成骨细胞的作用很复杂，部分取决于TGFβ的浓度、细胞密度、种系和成骨细胞的分化阶段. 多数研究认为TGFβ能抑制成骨细胞游离钙的合成、增加成骨细胞分化以及成骨细胞胶原和ALP的表达. TGFβ对成骨细胞生长有调控作用，这种作用在一定程度上表现为双相性. 研究表明，含血清培养的成骨细胞，低浓度的TGFβ可以刺激细胞DNA和胶原合成，抑制ALP活性，刺激细胞生长；而高浓度则抑制胶原合成，对DNA合成无作用. 无血清培养的成骨细胞，高浓度TGFβ抑制ALP生成. 此外，也有研究表明，TGFβ促进骨髓源性和骨膜源性骨前体细胞趋化到骨软骨损伤部位，进而增生、分化形成成骨细胞和软骨细胞 ［21］.

2.5成纤维细胞生长因子FGF是一种对中胚层和神经外胚层细胞具有促有丝分裂作用的多肽生长因子. 它对成骨细胞具有促增殖作用，并且通过增殖骨细胞数目促进骨形成. FGF分为酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因(bFGF)两种. aFGF存在于骨细胞浸出物中，bFGF存在于牛和人的骨骼中，前者较后者低10倍. FGF是毛细血管增殖刺激剂，能够促进毛细血管向断端内以及骨移植物中长入，使骨修复早期的组织中软骨岛数量增加，并使骨折断端骨痂血管重建的时间提前，而且可以增加BMP的成骨量. 目前虽然FGF的作用机制还不是很清楚，但是可以肯定的是局部和全身应用FGF可以促进骨形成. bFGF是一种内源性多肽生长因子，有试验表明它能有促进中胚层和神经外胚层细胞有丝分裂的作用 ［22］.

2．6血小板源性生长因子PDGF 首先在血小板中发现，分子量为28～35 ku，由两个多肽键A和B组成异二聚体，在体外具有促进纤维细胞生长的作用，对所有起源于间叶细胞包括成骨细胞既能促进骨形成，又能刺激骨吸收，起双向调节作用［23］. PDGF还对中胚层细胞有促有丝分裂作用，它对人和鼠成骨细胞及其细胞系均有促有丝分裂作用. 同时它还是一个强力趋化因子，对人和鼠组织中的成骨细胞有强烈的趋化作用. PDGF 是由血小板、巨噬细胞和骨细胞合成，贮存于骨基质中. 它在创伤愈合中起重要作用，称为“创伤因子”. 其主要功能是诱导成骨细胞和骨祖细胞分裂，对于培养的成骨细胞有强烈的趋化作用，能刺激胶原合成. Canalis等［24］发现: PDGF有与IGFⅠ同样的作用，能刺激鼠骨DNA及胶原合成，但是PDGF也具有促使胶原降解的性能.

2．7类胰岛素生长因子IGF家族由两种相关多肽组成，即IGFⅠ和IGFⅡ. 它们是骨基质中最富含的生长因子，两者有相似的结构和体外作用，但在体内生物学效应不同. IGFI 在细胞增殖及细胞外基质合成代谢中具有重要作用. Throp等［25］研究证实了IGFⅠ和TGFβ具有相互作用以促进细胞增殖、胶原及蛋白聚糖合成的作用.

IGFⅡ是重要的细胞内调节剂，能刺激骨细胞的增生、增加骨细胞的分化和I型胶原合成. Strong等［26］发现IGFⅡ能在正常人骨细胞培养中24 h 内增加原胶原mRNA 2～4 倍.

综上所述，细胞因子不过是众多因子中研究较为成熟的几个，如何把这些因子的作用应用于组织工程中，才是我们研究生长因子的目的. 什么样的方法才能使细胞因子的活性在组织工程中发挥最好的作用还要进一步探讨.

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篇2

1　成纤维细胞的来源及其生物学特性

成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。

成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这

两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4，5］。

处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。

2　成纤维细胞在一般创伤修复中的表现

各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程［6，8］。

3　成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现

最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段［4］。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于骨折局部血肿中［6］，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分［4，5］。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞［4，5，9～11］。

4　成纤维细胞的成骨作用

成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的表现，以及在某些病理条件下可以参与异位骨化［6，7］，使人们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成骨能力的研究也正是开始于对骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。

对骨折局部骨形成区的电镜观察显示，除了成骨细胞在此发挥成骨作用外，成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现［4，5，9～13］。例如，在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒，部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维，分泌到其四周的胶原纤维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此，成纤维细胞还能象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成丛毛球状的钙球，钙球随后合并、融合为骨组织。以上种种现象表明，成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂的演变过程中，成纤维细胞也随之演变为骨细胞，与成骨细胞的归宿相一致。但二者在演变过程中的

表现又不尽相同，主要有以下几点可资鉴别［9，13］：①成纤维细胞及其细胞核均呈不规则的椭圆形或长方形，而成骨细胞及其细胞核则为边缘比较光整的椭圆形；②成纤维细胞均单独存在，细胞之间有众多的胶原纤维相隔，成骨细胞则以连续排列的形式出现；③成纤维细胞的细胞质内溶酶体少见，而成骨细胞的细胞质内则常有溶酶体可见；④成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或针状钙盐结晶组成，成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密的骨组织；⑤成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变为骨细胞，而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组织包围在一个陷窝内，然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔为各占一个骨陷窝。

对成纤维细胞的成骨作用，有学者认为这是成纤维细胞的固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨组织及软骨组织，以及骨基质中的某些大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨细胞［14，15］。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)即对成纤维细胞有一定的诱导作用。对骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明创伤使内源性BMP呈阶段性合成与释放，并诱导周围软组织中的间充质细胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用PAP法发现［16］，骨折后第3、5天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细胞内以及第14天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充质细胞内，都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在BMP，表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌BMP、具有成骨作用的细胞。而Sampath［15］从牛骨基质中分离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了BMP和当时已知的其它骨生长因子。

成纤维细胞在其成骨作用得以表达后，可能通过两种方式成骨：①膜内成骨；②在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌胶原纤维后，参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿［4，5，9，13］：①变性、死亡、碎裂直至消失，这种演变发生早、范围广，故从纤维性骨痂形成开始，就逐渐有基质成分发生钙化，进而转变为骨基质；②演变为骨细胞，这一过程出现较晚，并穿插在前一过程之中，故在形成骨组织的细胞成分的同时，还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂，形成骨组织。但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞，其结局如何、其生物学特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如，骨细胞从骨陷窝脱离后，可恢复为功能活跃的成骨细胞，再次参与骨组织的形成；而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨陷窝后，是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。

5　成纤维细胞体外培养的生物学特性［18］

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。

6　成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则

指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。

为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMP-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMP-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。

7　展望

尽管成纤维细胞受哪些因素诱导可以产生成骨作用、这些因素的诱导方式及其机制如何以及成纤维细胞在骨形成中是否分化为成骨细胞等等问题尚未完全解决，但成纤维细胞经诱导可以形成骨组织这一现象已逐渐为广大科学工作者所接受。由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，可以设想，利用成纤维细胞分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增生繁殖较快等较其它具有成骨作用的细胞(如骨膜成骨细胞、骨髓基质细胞等)优越之处，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMP等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。在组织工程技术和生物材料科学已有较大发展的今天，这一设想是极有可能实现的。当然，从目前所处的实验阶段过渡到临床应用尚有很大一段距离，需要解决的问题还很多，而且随着研究的展开和深入，问题可能还会越来越多，但这确实是一项很有临床应用价值和社会、经济效益的重大课题，值得广大基础医学工作者和临床科研人员为之而努力。

参考文献

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［10］Chai bF， Zhu XL， Yang LF，et al. Ultrastructural investition of experimental fracture healing-Ⅲ:electron microscopic observation on deposition of calcium salt crystals. Clin Med J，1979，92(10):668

［11］Tang xM， Chai BF. Ultrastructural investition of experimental fracture healing-Ⅳ：electron microscopic observation on transformation and fate of fibroblast and chondrocytes. Clin Med J，1981，94(5):291

［12］柴本甫，汤雪明，李　慧.实验性骨折愈合中钙化骨化的超微结构观察(兼论成纤维细胞的成骨作用).中华创伤杂志，1995，11(1)：4

［13］柴本甫，汤雪明，李　慧.骨折二期愈合过程中的成纤维细胞成骨作用.中华骨科杂志，1996，16(4)：245

［14］Mckibbin b. The biology of fracture healing in long bone. J Bome Joint surg(Br)，1978，60(1):150

［15］Sampath tK， Desimone DP， Reddi AH. Extracellular bone matrix-derived growth factor. Exp cell Res，1982，142(1):460

［16］马真胜，胡蕴玉，吕　荣，等.骨形态发生蛋白在闭合性长骨骨折愈合中的作用.中华实验外科杂志，1997，14(1)：50

［17］Onishi t， Ishidou Y， Nagamine T， et al. Distinct and overlapping patterns of localization of bone morphogenetic protein (BMP) family memebrs and a BMP typeⅡ receptor during fracture healing in rast. Bone， 1998，22(6):605

［18］司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养.西安.世界图书出版公司，1996.7～12

［19］Friedenstein a. Induction of bone tissue by transitional epithelium. Clin Orthop， 1968，59:21

篇3

成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。

成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4，5］。

处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。

2　成纤维细胞在一般创伤修复中的表现

各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程［6，8］。

3　成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现

最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段［4］。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于骨折局部血肿中［6］，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分［4，5］。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞［4，5，9～11］。

4　成纤维细胞的成骨作用

成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的表现，以及在某些病理条件下可以参与异位骨化［6，7］，使人们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成骨能力的研究也正是开始于对骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。

对骨折局部骨形成区的电镜观察显示，除了成骨细胞在此发挥成骨作用外，成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现［4，5，9～13］。例如，在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒，部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维，分泌到其四周的胶原纤维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此，成纤维细胞还能象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成丛毛球状的钙球，钙球随后合并、融合为骨组织。以上种种现象表明，成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂的演变过程中，成纤维细胞也随之演变为骨细胞，与成骨细胞的归宿相一致。但二者在演变过程中的表现又不尽相同，主要有以下几点可资鉴别［9，13］：①成纤维细胞及其细胞核均呈不规则的椭圆形或长方形，而成骨细胞及其细胞核则为边缘比较光整的椭圆形；②成纤维细胞均单独存在，细胞之间有众多的胶原纤维相隔，成骨细胞则以连续排列的形式出现；③成纤维细胞的细胞质内溶酶体少见，而成骨细胞的细胞质内则常有溶酶体可见；④成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或针状钙盐结晶组成，成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密的骨组织；⑤成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变为骨细胞，而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组织包围在一个陷窝内，然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔为各占一个骨陷窝。

对成纤维细胞的成骨作用，有学者认为这是成纤维细胞的固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨组织及软骨组织，以及骨基质中的某些大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨细胞［14，15］。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)即对成纤维细胞有一定的诱导作用。对骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明创伤使内源性BMP呈阶段性合成与释放，并诱导周围软组织中的间充质细胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用PAP法发现［16］，骨折后第3、5天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细胞内以及第14天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充质细胞内，都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在BMP，表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌BMP、具有成骨作用的细胞。而Sampath［15］从牛骨基质中分离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了BMP和当时已知的其它骨生长因子。转贴于

成纤维细胞在其成骨作用得以表达后，可能通过两种方式成骨：①膜内成骨；②在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌胶原纤维后，参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿［4，5，9，13］：①变性、死亡、碎裂直至消失，这种演变发生早、范围广，故从纤维性骨痂形成开始，就逐渐有基质成分发生钙化，进而转变为骨基质；②演变为骨细胞，这一过程出现较晚，并穿插在前一过程之中，故在形成骨组织的细胞成分的同时，还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂，形成骨组织。但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞，其结局如何、其生物学特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如，骨细胞从骨陷窝脱离后，可恢复为功能活跃的成骨细胞，再次参与骨组织的形成；而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨陷窝后，是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。

5　成纤维细胞体外培养的生物学特性［18］

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。

6　成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。

为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMP-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMP-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。

7　展望

尽管成纤维细胞受哪些因素诱导可以产生成骨作用、这些因素的诱导方式及其机制如何以及成纤维细胞在骨形成中是否分化为成骨细胞等等问题尚未完全解决，但成纤维细胞经诱导可以形成骨组织这一现象已逐渐为广大科学工作者所接受。由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，可以设想，利用成纤维细胞分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增生繁殖较快等较其它具有成骨作用的细胞(如骨膜成骨细胞、骨髓基质细胞等)优越之处，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMP等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。在组织工程技术和生物材料科学已有较大发展的今天，这一设想是极有可能实现的。当然，从目前所处的实验阶段过渡到临床应用尚有很大一段距离，需要解决的问题还很多，而且随着研究的展开和深入，问题可能还会越来越多，但这确实是一项很有临床应用价值和社会、经济效益的重大课题，值得广大基础医学工作者和临床科研人员为之而努力。

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［3］饶寒敏，徐荣辉，朱雅萍，等.家兔皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用(显微录象与四环素标记观察).中华骨科杂志，1995，15(5)：295

［4］柴本甫，汤雪明.实验性骨折愈合的超微结构研究。中华外科杂志，1979，17：368

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［8］Brighton cT， Lorich DG， Kupcha R， et al. The pericyte as a possible osteoblast progenitor cell. Clin Orthop，1992，275(2)：287

［9］柴本甫，汤雪明.实验性骨折愈合的超微结构研究-成纤维细胞成骨作用的电子显微镜观察.中华实验外科杂志，1985，2(4)：157

［10］Chai bF， Zhu XL， Yang LF，et al. Ultrastructural investition of experimental fracture healing-Ⅲ:electron microscopic observation on deposition of calcium salt crystals. Clin Med J，1979，92(10):668转贴于

［11］Tang xM， Chai BF. Ultrastructural investition of experimental fracture healing-Ⅳ：electron microscopic observation on transformation and fate of fibroblast and chondrocytes. Clin Med J，1981，94(5):291

［12］柴本甫，汤雪明，李　慧.实验性骨折愈合中钙化骨化的超微结构观察(兼论成纤维细胞的成骨作用).中华创伤杂志，1995，11(1)：4

［13］柴本甫，汤雪明，李　慧.骨折二期愈合过程中的成纤维细胞成骨作用.中华骨科杂志，1996，16(4)：245

［14］Mckibbin b. The biology of fracture healing in long bone. J Bome Joint surg(Br)，1978，60(1):150

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［16］马真胜，胡蕴玉，吕　荣，等.骨形态发生蛋白在闭合性长骨骨折愈合中的作用.中华实验外科杂志，1997，14(1)：50

［17］Onishi t， Ishidou Y， Nagamine T， et al. Distinct and overlapping patterns of localization of bone morphogenetic protein (BMP) family memebrs and a BMP typeⅡ receptor during fracture healing in rast. Bone， 1998，22(6):605

［18］司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养.西安.世界图书出版公司，1996.7～12

［19］Friedenstein a. Induction of bone tissue by transitional epithelium. Clin Orthop， 1968，59:21

篇4

【关键词】 莱菔子水溶性生物碱；ApoE基因敲除小鼠；抗氧化

莱菔子是十字花科植物萝卜(Raphanus sativus L.)的干燥成熟种子，在《日华子本草》中记为萝卜子。其性味辛、甘、平，归肺、脾、胃经，主要功效为降气化痰，消食除胀。《本草纲目》记载：“莱菔子长于利气”。莱菔子水溶性生物碱以芥子碱(Sinapine)为主要成分，广泛存在于十字花科植物中的一种季胺盐物质。本实验通过观察莱菔子水溶性生物碱对载脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)影响来探讨莱菔子水溶性生物碱抗动脉粥样硬化（AS）作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品制备

莱菔子水溶性生物碱，由吉林省中医中药研究院新药中心制备。

1.1.2 实验动物

北京维通利华公司提供雄性ApoE基因敲除小鼠75只，雄性C57BL/6J小鼠15只，13周龄，体重（22±2）g，清洁级。

1.1.3 主要仪器及试剂

电子记重秤AWH（SI）-2.5 kg：国产；BD/BC518 -20℃冰箱：国产；4℃冰箱：国产；Q/IFGM0182000低温高速离心机：德国；HH·W21·600电热恒温水浴箱，小型台式离心机：上海医疗器械厂；PERLONG；pus2018 半自动生化分析仪：北京普朗新技术有限公司。

1.1.4 基础饲料

玉米粉26.0％，面粉29.0％，豆粕28.0％，磷酸氢钙1.4％，石粉1.6％，鱼粉5.0％，骨粉5.0％，盐1.0％，多种维生素1.5％，多种微量元素1.5％。

1.1.5 肥甘饲料

由10.0%猪油，2.0%胆固醇，20.0％蔗糖，5.0%蛋黄粉，0.2%胆盐，0.2%甲基硫氧嘧啶，62.6%基础饲料配制而成。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药

将ApoE基因敲除小鼠（高脂饮食）随机分为5组，每组15只。模型组，每日灌服饮用水；莱菔子水溶性生物碱高剂量组90 mg·kg-1·d-1，莱中剂量组60 mg·kg-1·d-1，低剂量组30 mg·kg-1·d-1(分别相当于生药60、40、20 g/kg)，血脂康组0.2 g·kg-1·d-1，另取10只C57BL/6J大鼠作为空白对照组。空白对照组及模型组给等体积蒸馏水灌胃。给药时间为8 w。

1.2.2 样本的采集及检测

给药8 w后，于末次给药后摘眼球取血处死动物。分离血清后，随机选取6个样本进行检测。NO试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 统计学方法

运用SPSS13.0软件进行计算，实验数据均采用x±s表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

治疗8 w后，各组小鼠血清NO、SOD及MDA变化比较，见表1。表1 各组治疗8 w后各项指标变化比较(略)

3 讨论

在AS的发生发展过程中伴随着机体氧化应激反应增强，氧自由基(OFR)产生增加，而机体具有抗氧化能力的SOD、谷胱苷肽过氧化物酶（GPX）活性及NO含量等明显降低，即抗氧化酶系的保护作用减低。OFR对血管内皮恭能的影响主要表现在〔1〕：①损伤内皮依赖的血管扩张。由于O-2灭活NO、GPX缺失等造成血管内皮功能障碍。②诱导内皮细胞凋亡。内皮损伤或暴露于O-2和H2O2诱导的细胞凋亡，以致AS发生和促凝血状态。③诱导内皮细胞黏附分子表达。④血管新生。除了对胚胎发育和创伤修复发挥生理作用外；在病理方面其可参与内皮细胞迁移、增殖和血管形成；此外，还参与血管VSMC的生长，迁移。

NO能够与脂氧化自由基直接反应而干扰低密度脂蛋白（LDL）的氧化过程，从而阻止氧化LDL（oxLDL）的生成及对内皮细胞的破坏。SOD是一种广泛存在生物体内的金属酶类。以O2为底物，是清除超氧离子自由基的特效酶类。脂质氧化应激的产物为MDA。本实验结果表明，各治疗组均能增加小鼠血清NO含量；提高血清SOD活性，降低MDA的含量，其调节作用随着剂量的增加而增强，呈剂量依赖性。莱菔子高剂量组

与血脂康组比较无显著差异。

NO是一种理想的抗AS因子，提高NO浓度可以改善血管内皮功能〔2〕。SOD又是清除氧自由基的专一酶，因此，莱菔子水溶性生物碱可能通过这一机制而发挥抗氧化和保护内皮细胞的作用。

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【Abstract】 AIM: To observe the effects of the demethylating agent， 5Aza2′deoxyctidine (5AzaCdR)， on the proliferation， cell cycle， apoptosis and xaf1 mRNA expression of stomach cancer BGC823 cells. METHODS: The proliferation of BGC823 cells treated by different concentrations of 5AzaCdR was detected by MTT assay. Assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (FCM); the change of xaf1 mRNA expression was semiquantified by RTPCR before and after 5AzaCdR treatment. RESULTS: The growth inhibitory effects on BGC823 cells were observed in a dosedependent manner after exposure to 5AzaCdR at different concentrations (1×103， 5×103， 10×103 nmol/L) for different time. FCM analysis showed that the apoptosis rates in BGC823 cells ［(4.53±0.21)%， (8.11±1.01)%， (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5AzaCdR for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%， P

【Keywords】 5AzaCdR；xaf1；BGC823；methylation；proliferation；apoptosis

0 引言

凋亡抑制蛋白因子家族(IAP)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(BIR)结构域［1］，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP中抑制Caspase活性最强的成员. XIAP相关因子1(XAF1)是一个新近发现可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转XIAP对细胞的保护. XAF1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，XAF1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关［2］. 我们采用5AzaCdR对胃癌细胞株进行处理， 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及治疗的新方法.

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌BGC823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；RPMI1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5AzaCdR（美国Sigma公司）；配制5AzaCdR为1 mol/L的母液，-20℃保存，使用时用RPMI1640稀释为工作浓度. Tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(BioTek公司)；Trizol(Invitrogen公司)；UV3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(Beckman Coulter公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于RPMI1640培养液中，内含100 mL/L胎牛血清、1×105/L青霉素、100 mg／L链霉素和2 mmol/L L谷氨酰胺，置于37℃ 50 mL/L CO2的饱和湿度箱中培养，每3～4 d消化传代1次. 传代时，常规消化BGC823细胞，置于75 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.

1.2.2 MTT法绘制细胞生长曲线 取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100 μL)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR药液的完全培养液，每孔100 μL，每组设3个复孔；对照组加入等量PBS. 每日取出1板加入5 g/L MTT液10 μL，37℃孵育4 h后加DMSO 150 μL，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔A470 nm值，求其平均值，以A470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线，计算细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR). CPIR(％)=(1-实验组A470 nm均值／对照组A470 nm均值)×100％.

1.2.3 RTPCR检测xaf1基因mRNA表达 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集细胞，Trizol一步反向法抽提细胞总RNA，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定RNA纯度，A260 nm／A280 nm在1.8～2.0之间. PCR引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56℃；Sense：5′TGGGTGTAGGATTCTCCAGG3′，Antisense：5′GGTTTGCCCAAGGACTACAA3′. 内参照GAPDH:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52℃；Sense：5′TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3′，Antisense：5′GTACATGGTATTCACCACCC3′，上述引物由大连宝生物有限公司提供合成. 两步法RTPCR：① 逆转录反应：20 μL反应体系含：2 μg模板RNA，0.5 g/L Oligo(dT)18，RNasefree ddH2O，5×Reaction Buffer，2×107 U/L RNase Inhibitor，10 mmol/L dNTP Mix，2×107 U/L AMuLV RT. 70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶链反应：50 μL反应体系含：cDNA 1 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，Tap酶0.5 μL，上下游引物各1 μL，去离子水补至50 μL，GAPDH作内参照. PCR仪扩增条件：94℃变性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸5 min. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和GAPDH吸光度比值相对定量.

1.2.4 细胞周期和凋亡率检测 取对数生长期BGC823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为1×109个／L，700 mL/L冷乙醇－20℃固定24 h，加RNaseA至终浓度1 g/L，37℃温育30 min，加碘化丙啶至终浓度50 g／L，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测.

统计学处理:实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.

2 结果

2.1 5AzaCdR对细胞增殖的影响 分别用1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理6 d后，BGC823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的CPIR值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（P

bP

图1 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后的生长曲线（略）

2.2 5AzaCdR对细胞中xaf1基因mRNA表达的影响 5AzaCdR处理前BGC823细胞系的xaf1基因mRNA不表达，在经5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理后，xaf1基因mRNA重新表达，10×103 nmol/L的5AzaCdR处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).

2.3 5AzaCdR对细胞周期的影响 BGC823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR处理72 h后，S期的细胞数量逐渐增加，G2/M期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h.

图2 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后GAPDH mRNA的表达（略）

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：对照组；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).

图3 BGC823细胞经5AzaCdR处理前后xaf1 mRNA的表达（略）

表1 BGC823细胞经5AzaCdR处理72 h后细胞周期的变化（略）

aP＜0.05， bP＜0.01 vs对照.

3 讨论

DNA甲基化是由S腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5甲基胞嘧啶(5mC)的化学修饰过程［3］. 近期研究表明，多种人类肿瘤在发展过程中表现异常DNA甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见［4］. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌［5］、结肠癌［6］、黑色素细胞瘤［7］组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5′区域CpG岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的CpG岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×103，10×103 nmol/L)的特异性DNMT抑制剂5AzaCdR，对体外培养的胃癌BGC823细胞进行干预，RTPCR结果显示在5AzaCdR作用前，xaf1 mRNA不表达，而在5AzaCdR作用后，xaf1 mRNA又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明DNA甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的DNA核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的［8］. 因此我们通过5AzaCdR人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化治疗肿瘤提供了理论基础.

凋亡在细胞增殖、肿瘤形成和发展中也起调控作用［9］. 我们应用不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/L)5AzaCdR诱导胃癌BGC823细胞后，MTT结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期分析可见S期的细胞数逐渐增加，G2/M期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于S期，而使得进入G2/M期的细胞减少，由此推断5AzaCdR的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制XIAP对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用［2］，xaf1也是一种新的干扰素(IFN)诱导基因，其介导了IFN诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］.

参考文献

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中图分类号：G852.6 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）22-0338-01

1.五禽戏的源流

古代仿生导引术，最早记载于《庄子・刻意》中的“吹呵呼吸，吐故纳新，熊经鸟伸，为寿而己，此导引之士，养形之人，彭祖寿考者之所好也。”其中的“熊经鸟伸”是模仿熊和鸟的动作来锻炼身体，又被称为“二禽戏”，与五禽戏有着异曲同工之处，可看作是五禽戏发展的雏形阶段。而后，在马王堆《导引图》，张家山汉墓《引书》，《淮南子》等[1]历史文献中都有关于多种模仿飞禽走兽动作的导引术记载，可看作是五禽戏发展的发展阶段。东汉末年的医学家华佗则根据仿生导引术、吐纳之术，集传统医学的阴阳、五行、藏象、经络等学说，进一步加以提炼和改进，通过观察各种飞禽走兽的运动形态，在继承和总结前人养生保健、延年益寿的经验基础上创编的“华佗五禽戏”[2]。经历时代变迁，五禽戏发展至今以多达20余种版本，新时代背景下，为了更好满足人们日益增长的健身养生需求，国家体育总局组织专家学者在古籍原有记载基础上整编而来，新编健身气功。五禽戏既继承了传统“五禽戏”的风格特点，又吸取了各流派的精髓，将中医养生与现代人体运动学、形体美学有机的结合而成，配合轻缓柔和音乐，彰显了时代特征，是一套取法自然，古老而又现代的养生保健运动。

2.中医养生

《淮南子・原道训》记载：“夫形者，生之舍也；气者，生之充也；神者，生之制也”。从中医养生中“保精护肾”的角度看，精、气、神乃人身“三宝”，精是构成人体和促进人体生长发育的基本物质[3]。精可化气，气可生神，神可御形，精是气、形、神的基础，为健康长寿的根本，反之，气、形、神是精的必要条件，为“保精护肾”提供能量。

从中医养生“形神共养”的原则看，形即形体，神即精神、意识。传统医学认为：“静以养神，为阴。”练习者可通过对机体心理活动的自觉控制，保持心理的宁静和“恬淡虚无”的精神境界，以增进身心的健康；“动以养形，为阳。”通过运动形体，疏通经络，促进气血运行，达到强筋壮骨效果。形与神、动与静、阴与阳均是对立统一、相互依存、相互影响的，只有达到彼此间协调平衡，遵从生命体的固有规律及人于世间万物相适应的规律，方能保持机体内部各脏器稳定及机体与外界物质能量交换的动态平衡。

3.新编五禽戏与中医养生保健

新编五禽戏是在前人经验基础上，以形体运动、呼吸吐纳、意识控制相结合为主要形式，通过模仿自然界五种动物的神形而创编。其讲求的“调身”、“调息”、“调神”与中医养生中的形、气、神相互对应。“调形”重在锻炼人的外在形体，强健筋骨；“调神”重在调节精神状态，心强脑健；“调气”通过呼吸吐纳，促进全身血液循环，增强脏腑功能。通过“三调”来实现形神合一，协调阴阳平衡，方能达到生命机体治病祛邪、养生保健、健康长寿的功效。

3.1 调形与养生保健

调形，指对身体姿势及的牵拉、调整、变换。调形是练习五禽戏的第一步，没有良好的姿势，就无从谈起调气和调神，更达不到养生之功效。古人云：“形不正则气不顺，气不顺则意不宁，意不宁则神散乱”，意思是调形是调气和调神的基础，只有形正才能进一步达到气定神闲效果。从调形的角度来分析五禽戏的每一个动作都别具匠心，重点突出，而整套动作又浑然一体，各戏之间相互呼应。

虎威生于爪，虎神发于目，爪与目皆属于肝，勤加练习可起到舒筋活络、养肝明目的作用。“虎举” 时，手臂向上拔伸，刺激躯干两侧肝胆经络，起到疏导肝胆气血的效果；“虎扑”时通过身体前后伸展，可增加脊柱各关节的伸展性和柔韧度，保持正常的生理曲度，疏通经络，调畅气血。

鹿好静立远眺，角抵时运转尾闾。中医理论认为，“腰为肾之府”，鹿抵”通过腰部左右扭动、胸内含脊柱后凸、尾闾的运转不但可增强腰部力量，还可起到壮腰、补肾、强筋、健骨的功效；“鹿奔”两臂内旋前伸，使肩背肌肉得到牵拉放松，躯干弓背收腹时则可增强腰背肌肉力量，起到防止、矫正脊柱畸形的作用。

熊戏主脾，通过 “熊运” 腰部摇摆，可按压脾胃，对消化器官进行体内按摩，使得中焦气血通畅，“熊晃”时，身体左右晃动，起到疏肝理气，增强消化系统效果，而提跨前行时又能增强髋关节肌肉力量。

猿戏主心，“猿提” 动作中“猿勾”，通过手臂夹胸收腋、上提下按、上肢大幅度运动，可增强肺部呼吸能力，按摩心脏，改善脑部供血情况；另外提踵动作可提高人体平衡能力，强化腿部力量。

鸟戏主肺，模仿仙鹤伸颈长望，展翅飞翔。鸟戏中“鸟伸”动作通过上肢的上举下按，牵拉任、督二脉，起到疏导经络作用；另外胸腔的开合直接刺激肺脏，加强肺吐故纳新能力，提高肺活量。“鸟飞”提膝独立，可提高身体平衡能力，拇指及食指上翘紧绷动作可刺激手太阴肺经，能有效疏导肺经，提高心肺工作能。

3.2 调神与养生保健

“神”指人的意识、思维、感觉等精神活动，也泛指机体的生命活动的外在表现，如眼神、表情、肢体姿态等。“调神”则指调养精神，神属静，与形相呼应，从而达到“形神合一”的中医养生之道。练习五禽戏要“入戏”，只有充分理解了五禽的“神”，才能通过动作展现其玩耍游戏时候神态、神韵，这也是其区别于其他健身功法的重要特点之一。

“虎戏”勾勒出猛虎伸腰、奔跑、扑食的场景，展示威严、勇猛的神韵。“虎举”神态要严肃威猛，“虎扑”神态要沉着凶猛。“鹿戏”勾勒出鹿自由奔跑，抵角游戏，展现自由奔放、祥和的神韵。“鹿抵”神态要轻灵祥和，“鹿奔”神态要自由奔放。“熊戏”勾勒出壮熊憨态摇摆和行走的场景，展现憨厚笨呆的神韵。“熊运”神态要憨态可掬，“熊晃”神态则要浑厚沉稳。“猿戏”勾勒出猿猴左顾右盼觅食摘果的场景，展示活泼机警的神韵。“猿提”神态要机智灵巧，“猿摘”神态要活泼敏捷。“鸟戏”勾勒出仙鹤仰首挺拔，展翅飞翔的场景，展示怡然自得的神韵。“鸟伸”神态要超然淡泊，“鸟飞”神态要悠然恬静。

3.3 调气与养生保健

调气，首先指调整呼吸的方式、节奏、强弱等，也称调息。即通过肢体形态的变化与呼吸吐纳的有机结合，逐步达到形、神、气的统一。呼吸是人本能的一种生理活动，也是练习五禽戏的重要环节之一，呼吸形式主要包括自然呼吸、腹式呼吸、停闭呼吸及提肛呼吸等。如在“猿戏”中猿提动作就运用提肛呼吸法，吸气时提收及会阴肌肉，呼气时则放松及会阴肌肉。练习五禽戏时，不管选用哪种呼吸方式，都要以松静自然，不憋气为基本原则，配合起吸落呼、先吸后呼、开吸合呼、蓄吸发呼等规律。

4 小结

新编五禽戏模仿五禽秉性特点，但又不拘泥形象，动作优美大方，配乐轻缓柔和，符合现代审美标准；结合传统医学的脏腑、经络、精气神学说等，新编五禽戏虽有较好的健身功效，但不同体质、不同健康状况的练习者，还需根据自身情况灵活掌控习练强度，以“汗出透”及“身体轻便”[4]等为基本原则，持之以恒，循序渐进，方能达到养生保健之功效。

参考文献

[1] 田启涛.“五禽戏”的发展源流及操练技巧[J]，宜宾学院学报.2011，11（7）：38-40.

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1.无公害蔬菜生产现状分析

1.1砚山县生产无公害蔬菜的优势

1.1.1气候条件优越。砚山县地处北回归线附近的低纬高原地带，属北亚热带季风气候。冬无严寒，夏无酷暑，四季温和的自然立体气候（年平均降雨量在850～1400mm，气温在12.5～18.6℃，全年理论日照为4421小时，霜期一般在62天左右），全县境内四季均可生产无公害蔬菜。

1.1.2土地资源丰富。砚山县的土地资源是比较丰富的，可以生产无公害蔬菜基地133.3hm2以上的大小坝子35个，共有面积7.07万hm2，占全县土地总面积的18.4%。其中，平远、稼依坝子的面积达4.07万hm2，是全省名列第8的大坝子。目前砚山县生产无公害蔬达0.73万hm2，占蔬菜栽种面积的10.4%。

1.1.3水资源丰富。砚山县年总降水量40亿万m3，经流量14亿万m3，占总降水量的35%，目前可控制水量为1.4亿万m3，占径流量的10%。其中：有6条小河，总长224.7km；共有河道引水工程342件，拦河坝32道，泉水71处，箐沟239条。

1.1.4交通条件良好。砚山县地处323国道线上，又是内地向沿海地区提供蔬菜的必经之路，在路途上远比建水、通海等蔬菜产区占有优势。目前砚山县由于各种原因，生产不出更多的无公害蔬菜，致使虽然砚山的地理位置好，区位优势好，交通便利，但没有得到其应有的效应。

1.2无公害蔬菜生产存在的问题

近年来我国种植业产业结构得到不断调整，我国蔬菜种植面积每年都处于不断扩大的趋势，同时也使得各类病虫害逐年加重。需要考虑的是，我国作为一个科学技术水平相对落后的国家，在蔬菜的种植与生产过程中，不可能完全拒绝使用农药，尤其是近些年病虫害不断加重的情况下，不使用农药很可能导致减产、绝收。因此，我国菜农在农药的使用及管理上仍然存在较大的问题，具体有以下几点。

1.2.1农药经营台帐问题。一是部份农药经营户进货、销售台帐记录不规范、不全面；二是部份农药经营户没做进货、销售台帐记录；三是农药摆放不规范；四是极少数存在不及时清理、销毁过期农药。

1.2.2经费短缺。资金不足仍然是制约农药监督管理工作的主要因素。比如一年一度的年审、上岗人员的继续培训及材料、办证、换证等费用都是从其它款项的费用中支出。

1.2.3农药市场不规范。农药市场分散，农药经营户多，执法人员少，造成农药管理人员在农药管理过程中困难重重。比如：不能同时顾及外勤的农药市场巡查和内勤的换证、办证，以及材料的上报等工作（农药管理涉及食品安全、农产品质量、办证、换证、市场巡查等工作，需要上报的材料很多）。

2.植保技术在无公害蔬菜生产中的作用分析

2.1改善蔬菜生产环境、加大食品安全宣传

选择无公害蔬菜生产环境必须要提高土壤、土地的选择标准，同时通过加强周边水土资源管理等措施，确保农作物用水的安全性，防止由于工业用水对农业生产产生的污染问题。其次，对于不同品种、不同特性的蔬菜，要结合其生长要求改善周边环境，如土壤环境、水资源环境等，从而确保各项环境指标均能够满足无公害蔬菜的生长条件。另外，在灌溉系统当中，也要采用高科技的灌溉技术，确保蔬菜在用水方面得到保障。不仅如此，还应继续大力宣传农产品质量安全，无公害农产品及绿色食品生产的重要意义。强化重点，树立榜样，重点发展龙头企业、种养大户等有规模、上档次的企业，同时要让每个人认识到无公害、绿色食品生产对环境、资源、经济、社会发展良性循环的重要作用。

2.2物理及生物防治技术的应用

在无公害蔬菜种植过程中，物理技术可改善蔬菜生产环境，通过物理手段建立一套有利于蔬菜生长的环境，通过抑制害虫生长的物理技术来促进蔬菜的生长。物理技术主要有温度、颜色及光线等，如采用糖醋剂、紫光灯等措施来吸引、杀死害虫，起到减少农药使用乃至替代农药的良好效果。

生物防治技术主要是利用蔬菜生长的特性，促进蔬菜的生长，即根据蔬菜在生物链中的位置特点，营造出一种有利于蔬菜生长的环境。比如利用生物之间的对抗性，保证无公害蔬菜的种植与产量。但需要考虑的是，生物防治技术效果的体现需要一定的时间过渡，因此要想结合物理技术的应用，起到制约害虫、促进蔬菜生长还有必要结合物理技术来取得较为良好的效果。

2.3强化无公害蔬菜病虫害农药防治管理

一般来说，通过应用化学防治技术能够较大规模、较好效果地实现病虫害的控制及防治工作。但采用化学防治技术还应严格控制化学药品的用量、时间、品种、频率，使用最少的化学药品，取得最佳的防治效果。此外，还应该注意化学农药的残留、病虫害发生的规律等确定化学药品的使用，将病虫害控制在早期阶段，确保化学农药的使用能够体现出更加优良的效果。

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目的 探讨Th1和Th2细胞因子表达谱研究在V型疮性肾炎(VLN)患者中的作用。方法 分离血清，通过抗体芯片技术同时检测4种Th1和5种Th2细胞因子表达谱，并探讨其与临床指标之间的相关性。结果 ①细胞因子表达谱：在同时检测的9种细胞因子中，VLN患者有4种表达上调，除了IL2属于Th1细胞因子外，其他三种(IL4、IL10和IL13)均属于Th2细胞因子，其中IL10较健康对照升高了10倍以上。②相关性研究：Pearson相关分析显示IL10与SLIEDAI呈正相关、与血红蛋白浓度呈负相关；此外，IL4和IL13均与尿蛋白浓度呈负相关，IL1与血肌苷之间呈正相关。结论 VLN患者体内细胞因子表达异常以Th2细胞因子为主，提示抗Th2细胞因子可能在V型狼疮患者中具有一定的治疗作用。

【关键词】 狼疮性肾炎；细胞因子；免疫

ABSTRACT: Objective To study the effects of cytokines Th1 and Th2 in Class V lupus nephritis (VLN). Methods Serum concentration of Th1 cytokines (IFNγ， IL1， IL2 and TNFα) and Th2 cytokines (IL4， IL5， IL6， IL10 and IL13) were simultaneously analyzed using fast quant human Th1/Th2 protein array， and Pearson analysis was used to evaluate the association between cytokines and clinical parameters. Results ① Cytokine profiling: Among the 9 cytokines detected simultaneously by fast quant human Th1/Th2 protein array， the expression of four cytokines was upregulated obviously， namely， Th1 cytokines (IL2) and Th2 cytokines (IL4， IL10 and IL13); that of IL10 was 10 times above the normal control. ② Pearson correlation analysis: There was a positive correlation between IL10 and SLEDAI (r=0.877， P

KEY WORDS: lupus nephritis; cytokine; immunity

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE) 是一种T细胞介导的、自身反应性B细胞高度增生、大量高亲和力的致病性的自身抗体产生的自身免疫性疾病[1]。狼疮性肾炎(lupus nephritis， LN)是SLE患者较常见的最严重的并发症和死亡的主要原因之一[2]。LN患者病程反复，伴有进展性的组织病变，疾病的死亡率居高不下，目前主要是通过应用非特异性免疫抑制剂和进行抗炎治疗。如果能了解SLE导致肾损伤的发病机制，发现新型的低毒性治疗方法，会更好的进行特异性的治疗，改善狼疮性肾炎患者的预后。

伴随着免疫细胞的数量和功能上的异常，细胞因子网络的变化对LN病程的演进有重要的作用：Th1型和Th2型细胞因子比例失调、细胞因子水平分泌增加或减少、细胞因子间相互的拮抗或协同作用增强或减弱等都参与了LN的发病过程[3]。但是，LN属于一种以肾脏形态学异常为基础的临床综合征，而且LN发病机制十分复杂，同一个患者可以同时存在多种细胞因子的异常，不能孤立的看待某一种细胞因子的异常，而多种细胞因子间的相互作用可能更为重要。因此，本实验以V型LN患者为基础，通过系统生物学的研究方法，借助高通量的抗体芯片技术同时观察V型LN患者血清多种细胞因子(包括Th1细胞因子和Th2细胞因子)的变化，以期从免疫学网络失衡角度阐明LN可能的发病机制，为治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病例选择

按照1982年美国风湿病协会SLE的诊断标准[4]选择狼疮性肾炎患者20例，均为女性，具有肾脏累及的临床表现；均进行肾活检。根据1985年WHO改良病理分型标准进行分型诊断符合弥漫膜性肾炎(V型)，根据SLEDAI评分(SLE Disease Activity Index)标准判断LN患者肾活检时疾病活动情况[5]，所有患者3月内未使用霉酚酸酯(MMF)或环磷酰胺(CTX)等强免疫抑制剂治疗。同时选择年龄和性别匹配的健康志愿者20例作为正常对照。

1.2 血清细胞因子检测

清晨抽取空腹静脉血5mL，离心后留取血清，-70℃保存待测。血清细胞因子的检测采用德国Whatman公司提供的抗体芯片，同时定量检测9种细胞因子的表达，其中包括4种Th1细胞因子IL1(白细胞介素1)、IL2(白细胞介素2)、IFNγ(γ干扰素)、TNFα(肿瘤坏死因子α)和5种Th2细胞因子IL4(白细胞介素4)、IL5(白细胞介素5)、IL6(白细胞介素6)、IL10(白细胞介素10)、IL13(白细胞介素13)的表达。每个因子检测设立3个复孔，取平均值。具体操作简述如下：玻片装上孵育室并将玻片/孵育室一起装入玻片夹；70μL封闭液室温封闭15min；常温孵育样品过夜(轻微振荡)；洗涤5次；生物素标记的抗体室温孵育60min(轻微振荡)；洗涤5次；StreptavidinCy5室温孵育45min(轻微振荡)；洗涤5次；DiH2O冲洗玻片并干燥；扫描玻片，进行资料分析。

1.3 其他实验室检查

所有患者同时进行以下检查：①24h尿蛋白定量：采用双缩脲比色法，正常值＜0.4g/24h；②自身抗体：抗核抗体(ANA)采用间接免疫荧光法，抗双链DNA(dsDNA)采用短膜虫法；③补体C3、C4：采用散射比浊法。

1.4 统计学方法

结果以均数±标准差表示。组间差异采用Students t检验，并通过Pearson相关性分析研究细胞因子表达及淋巴细胞亚群与临床指标之间的相关性。以P

2 结 果

2.1 患者的临床实验室的相关检查

V型LN患者一般临床资料见表1。V型LN患者白细胞、血红蛋白、补体C3和C4均明显低于健康对照组。与健康对照相比，白细胞计数分别为(5.015±1.426)×109/L和(6.271±2.730)×109/L(P

2.2 血清细胞因子的表达谱

V型LN患者所检测的9种细胞因子中有4种较对照组升高，除IL2属Th1细胞因子外(P

为明确细胞因子增长情况，我们以健康对照组细胞因子平均值为基数，观察了每种细胞因子增长幅度，发现V型LN患者升高最明显的细胞因子是IL10，较对照组升高了10倍以上，其他几种细胞因子增高幅度均在3～5倍之间，提示在LN中存在明显的细胞因子的比例失衡，细胞因子网络之间的平衡被打破，表现为细胞因子上调幅度不均一。表2 V型狼疮性肾炎和健康对照组Th1、Th2细胞因子浓度的变化（略）

2.3 相关性研究

Pearson相关分析显示，主要是Th2细胞因子与临床表现之间存在明显的相关性，尤其是IL10，如IL10与SLIEDAI呈正相关(r=0.877，P

3 讨 论

LN是我国最常见的继发性肾小球肾炎，其临床和肾脏病理改变存在显著的不均一性和多样性，不同的病理类型不仅反应了形态学上的差异，更可能蕴含不同的发病机制。V型病变表现为膜性病变，以上皮侧免疫复合物沉积和补体沉积为主要特征，临床上以大量蛋白尿为突出表现，但其发病机制尚未完全阐明。

如前所述，细胞因子参与免疫反应的每一个环节。细胞因子网络中，Th1/Th2细胞因子的失衡尤为受到研究者的关注，目前有Th2优势、Th1优势以及Th1向Th2转化发展的优势等[6]不同的假说。但是，Th1/Th2各代表了一组细胞因子，如果能同时检测多种细胞因子表达，将对研究细胞因子失衡在LN中的作用具有重要意义。抗体芯片可以一次性的检测上百上千种蛋白质的表达丰度，具有特异性强，敏感性高，检测范围广等优势。因此，本实验采用系统生物学的研究方法，通过高通量的抗体芯片技术对V型LN患者体内9种细胞因子(包括Th1和Th2细胞因子)同时进行分析，以便全面了解V型LN患者体内细胞因子的表达情况。

本实验首先对细胞因子表达进行综合分析，发现所检测的9种细胞因子有4种明显升高，包括一种Th1细胞因子和3种Th2细胞因子。但是，增长幅度显著不同，以Th2细胞因子增长最明显，其中IL10增加最显著，较健康对照组升高10倍以上，提示VLN患者体内细胞因子表达平衡被打破。作为Th2细胞因子的代表， IL10 在SLE 体液免疫激活和自身抗体产生中有不可忽视的促进作用。已有研究发现，IL10基因多态性不仅与LN 全身活动性相关，还对肾脏的临床活动和免疫病理损害产生影响[7]。自身抗体的产生是SLE发病机制中的关键因素，与其相应的自身成分结合成循环免疫复合物在机体各处沉积，激活补体系统，引发炎症反应，造成广泛的组织损伤[89]。作为B细胞活化和增殖的促进因子，IL10血清水平的升高恰好可以解释LN患者免疫系统的功能失调。

目前，关于细胞因子与LN疾病的相关性研究主要集中于细胞因子与狼疮疾病活动性指数、自身抗体之间的相关性上。但是，在此方面却存在较大争议。例如，RAPLEY等报道IL6水平与SLE活动性相关[10]，WAIS却认为IL6与SLE活动性无相关性[11]；作为一种Th1细胞因子，IFNγ在SLE发病机制中具有重要作用[12]，而在本研究中发现VLN型患者体内IFNγ无明显改变，考虑与患者入选标准不同、细胞因子检测方法不同有关。本实验中发现主要是Th2细胞因子与临床表现之间存在相关性。例如，IL10与SLEDAI呈正相关，与血红蛋白浓度呈负相关；IL4和IL13均与尿蛋白浓度呈负相关，提示Th2细胞因子可能参与肾脏疾病进展。但是，本研究主要选择未经过强免疫抑制剂治疗的患者，如果能增加部分活动性相对较弱的病例，或对入选患者进行免疫抑制剂治疗后做纵向对比分析，可能会提供更有意义的数据，可通过治疗前后细胞因子的变化判断LN治疗的效果，即细胞因子可能成为判断LN病情及治疗效果的生物学标记物。

狼疮性肾炎是发病机制复杂的异质性疾病，不仅淋巴细胞参与其中[13]，复杂的细胞因子免疫调控网络，及其受体间平衡紊乱也可能参与狼疮性肾炎的发生、发展。本研究发现V型狼疮性肾炎患者体内存在广泛的淋巴细胞异常及细胞因子表达谱异常，提示显著的免疫功能紊乱。这可能是目前免疫抑制剂治疗狼疮性肾炎的基础。但是，本课题仅限于未经强免疫抑制剂治疗的患者，如果能增加部分治疗后的随访观察结果，可能会对狼疮性肾炎的免疫学发病机制及免疫抑制剂的治疗机制提供进一步的理论基础。

参考文献

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[5]WONG CK， HO CY， LI EK， et al. Elavation of proinflammatory cytokine(IL18， IL17， IL12) and Th2 cytokine(IL4) concentrations in patients with systemic lupus erythematosus [J]. Lupus， 2000， 9(8):589593.

[6]DE LA TORRE M， URRA JM， BLANCO J. Raised expression of cytokine receptor gp130 subunit on peripheral lymphocytes of patients with active lupus. A useful tool for monitoring the disease activity [J]? Lupus， 2009， 18(3):216222.

[7]CHUN HY， CHUNG JW， KIM HA， et al. Cytokine IL6 and IL10 as biomarkers in systemic lupus erythematosus [J]. J Clin Immunol， 2007， 27(5):461466.

[8]ZHOU YB， YE RG， LI YJ， et al. Effect of antiCD134L mAb and CTLA4Ig on ConAinduced proliferation， Th cytokine secretion， and antidsDNA antibody production in spleen cells from lupusprone BXSB mice [J]. Autoimmunity， 2008， 41(5):395404.

[9]LU MC， LAI NS， YU HC， et al.Nifedipine suppresses Th1/Th2 cytokine production and increased apoptosis of antiCD3+ antiCD28activated mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus via calcineurin pathway [J]. Clin Immunol， 2008， 129(3):462470.

[10]RIPLEY BJ， GONCALVES B， ISENBERG DA， et al. Raised levels of interleukin 6 in systemic lupus erythematosus correlate with anaemia [J]. Ann Rheum Dis， 2005， 64(6):849853.

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伴随着21世纪的到来， 世界范围内的科技革命突飞猛进，数字化、智能化、网络化等各种高新技术正向各个领域全方位渗透，警务方式也发生了革命性的变革，情报主导警务模式便成为当前警务工作方式的主流。面对新型警务模式的建立，出入境管理部门必须主动适应信息化社会的客观要求，牢固树立情报信息主导警务的观念，切实增强出入境情报信息管理工作的针对性、有效性和预见性，推动出入境管理工作的全面和可持续发展。

一、加强涉外警务专业学生情报信息应用能力的培养是为从事出入境管理工作垫定基础。

（一）情报信息的应用是出入境管理工作中的中端业务。

出入境管理部门作为一个涉外的、公开实施行政管理的部门， 主要是代表国家行使出入境管理职能， 不仅其自身业务的发展和提高离不开情报信息工作， 而且出入境管理部门还必须通过开展和加强情报信息工作，为建设公安信息化队伍的整体工作服务。

（二）当前出入境管理工作中情报信息应用存在的问题。

1.出入境管理部门中公安民警的情报素质相对较低具体表现在以下几个方面：（1）公安民警对出入境情报信息收集工作的认识不够， 在思想上还停留在单纯以上报数量或获取名次来衡量工作成绩的倾向。（2）公安民警发现情报信息的敏感性不足，缺乏一名合格情报人员对情报信息所应具有的职业敏感性。（3）公安民警收集情报信息的方法不得当，对于情报信息的收集仅仅停留在直接获取的层次，而对于间接收集情报信息的方法没有做深入研究。

2.情报信息在出入境管理工作中没有得到全面发挥。由于出入境管理部门中公安民警的情报素质相对较低，对于公安情报信息系统的使用也不够熟悉，一些建立得较为完善的信息系统，大多还停留在资料库、数据库的利用上，只发挥出有限的查询功能，系统更高级的功能没有得到发挥。这是致使情报信息在出入境管理工作中没有得到全面发挥的主要原因。

3.出入境管理部门的公安民警在情报信息应用方面的培训与实战脱轨。出入境管理部门十分重视情报信息在其工作的重要作用，也经常给内部民警做业务培训。问题的关键是培训的内容针对性不强，只是围绕公安系统的大框架介绍情报信息的应用，而没有针对出入境管理工作中情报信息的应用展开分析。导致公安民警所学知识与实战脱轨，无法适应实战。

（三）加强涉外警务专业学生情报信息应用能力的重要性。

当前，出入境管理部门情报信息工作面临的严峻形势要求公安院校必须加强涉外警务专业学生情报信息工作能力的培养。作为涉外警务专业学生，我们肩负着维护祖国出入境管理秩序，保卫祖国边防安宁的神圣使命，因此必须要树立正确的世界观、价值观、人生观，努力提升自己，以适应社会的需求，适应出入境管理工作对出入境人才的需求。

二、涉外警务专业学生在出入境管理工作中情报信息应用能力的培养目标。

（一）培养学生学习情报信息的积极兴趣。

1.大力给学生贯彻情报主导警务的理念，让学生认识到情报信息应用能力在出入境管理工作中的重要意义。教师在平日的教学中要让学生认识到情报信息是出入境管理工作的生命线，是科学决策的基础，及时、准确、适用的情报信息是出入境管理部门克敌制胜的法宝。当情报主导警务的理念深入学生心中时，他们学习情报信息的兴趣也会有很大的提高。“良好的开端是成功的一半”，只要激发出了学生学习情报信息的兴趣，就能将他们培养出他们在出入境管理工作中情报信息应用能力。

2.促成学生研究情报信息知识的主观能动性，让学生形成主动在出入境管理工作中应用情报信息的潜意识。学习情报信息知识的特点在于易学难精，所以对学生而言，只有学习情报信息知识的一腔热血是远远不够的，最重要的是要有研究情报信息知识的主观能动性。自觉地在情报信息知识的领域内钻研，领会情报信息知识的精华所在，自如的将情报信息应用到出入境管理中去，形成一种在出入境管理工作中应用情报信息的潜意识，提升自身在出入境管理工作中情报信息应用的能力。

（二）培养学生在出入境管理工作中情报信息的收集能力和判断能力。

1.提醒学生多留意出入境管理各方面的信息资源，让学生养成积极捕捉情报信息的好习惯。“凡事预则立，不预则废”，情报信息工作能力的形成是一个漫长而艰巨的过程，在这期间需要大量的情报信息的积累。因此教师在平日的学习生活中要提醒学生多留意出入境管理各方面的信息资源，让学生养成积极捕捉情报信息的好习惯。“世事洞明介学问，人情练达介文章”，通过大量信息情报的积累，学生的思维无意识就会向情报信息方面靠拢。当这种思维过程已经成为习惯性模式嵌入意识深处，变为一种自觉心理倾向，情报意识也就形成了。

2.增强学生对出入境情报信息的职业敏感性，让学生形成敏锐的情报判断能力。出入境情报信息工作做为一项特殊行业的工作，欲将其做好，必须增强对情报信息的职业敏感性，形成敏锐的情报判断能力。对于情报判断能力的提高需从两个方面着手：一是对相关信息进行初步的分析研判， 防止大量信息垃圾的污染， 提高情报的收集效率。二是对情报进行系统的分析， 各方面信息综合考虑， 相互比对、印证， 这样能够保证情报分析研判工作的准确性， 实现情报的优势。

（三）培养学生出入境管理工作中情报信息应用的创造性。

1.丰富学生在出入境情报信息方面的知识，让学生在出入境情报信息方面的思维得到扩展。情报信息方面的知识不是一成不变的，是不断更新的，其更新周期的不断缩短就要求我们不断更新知识。教师应着力丰富学生在出入境情报信息方面的知识，增强学生出入境情报信息知识需求意识，提高他们的检索技能，通过大量的出入境情报信息知识的积累，使学生在出入境情报信息方面的思维得到扩展。

2.肯定学生在出入境情报信息领域内的想象力，让学生在出入境情报信息应用之中添加自己的创新之处。出入境情报领域是一个没有边界的领域，在没有边界的学科研究中就不能否认学生独到的见解之处。就出入境情报信息应用而言，学生往往会想出很多新的方法将情报信息更好的衔接在出入境管理工作之中。此时，作为教师就应该肯定学生在出入境情报信息领域的想象力，让其在以后的工作中发挥更大的创造力。

三、涉外警务专业学生在出入境管理工作中情报信息应用能力的培养途径。

（一）加强涉外警务系教师情报主导警务的理念，激发学生学习情报信息的兴趣。

出入境情报信息工作是一项实践性很强的工作，学生欲想了解其中的技巧性，仅仅通过聆听缺乏实战经验的教师讲述理论知识是远远不够的。因此公安院校必须邀请长期从事出入境情报信息工作的民警来学校给教师和学生授课、作讲座，介绍出入境管理中情报信息工作的经验与做法。同时选派涉外警务系的教师到出入境管理部门挂职锻炼，增强出入境情报信息工作实践经验，提升教师队伍的素质和授课水平。教师要积极关注国内外有关出入境情报信息工作的最新动态，了解出入境管理工作中情报信息应用的最新方法，及时传递给学生，活跃学生思维，激发他们学习情报信息的兴趣，培养他们出入境情报信息应用意识，提高他们在出入境管理工作中情报信息应用的能力。

（二）加强学生在出入境管理工作中情报信息实际应用能力，让其在实践工作之中提升自身情报信息的收集能力和判断能力。

出入境信息工作极具实践性的特性要求学生必须具有实际应用能力。教育与实践相结合是提高情报信息应用能力的根本方法，因此校方应该加强学生在出入境管理工作中情报信息实际应用能力，尽可能多的让学生到出入境管理部门进行实习工作，更多的接触出入境管理工作中情报信息方面的知识。学生要积极利用见习和实习的机会，把在学校所学的有关出入境情报信息工作的理论运用到实际出入境管理工作中，在实践工作中提升自身情报信息的收集能力和判断能力。

（三）拓宽学生在出入境情报信息领域之中的知识面，努力开发其在出入境情报信息应用之中的创新潜能。

出入境情报信息领域所涉及的知识十分广阔，并且知识的更新周期也日渐缩短。因此教师应该尽可能多收集国内外有关情报信息的书籍，开拓情报信息工作的思路。同时应该通过讲座、培训的形式给学生讲授与出入境情报信息有关联的学科的基础知识，特别要重点讲授手工检索、国际联机检索等知识，使学生尽早掌握常用的中外检索工具的使用方法，接触到出入境情报信息领域内的更多更新的知识。学生通过研究出入境情报信息方面的知识，得出自己在出入境情报信息工作上的独到见解，努力开发自身在出入境情报信息应用中的创新潜能。

四、结语

总而言之， 在情报主导出入境管理工作的体系下公安教育也应与时俱进， 注重涉外警务专业学生在出入境管理工作中情报信息应用能力的培养，使学生毕业后适应情报主导出入境管理体系下的工作要求，推进出入境管理工作信息化的建设。

参考文献：

[1]郭媛珠.论加强公安院校学生情报信息工作能力的培养[J].福建公安高等专科学校学报，2007.

[2]王刚.出入境情报信息工作的现状分析与对策思考[J].上海公安高等专科学校学报，2010.

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一、生物的特征

1、生物的生活需要营养

2、生物能进行呼吸

3、生物能排出体内产生的废物

4、生物能对外界刺激做出反应

5、生物能生长和繁殖

6、生物都有遗传和变异的特性

6、生物都是由细胞构成的（病毒除外）

观察是科学探究的一种基本方法，可以直接用肉眼，也可以借助放大镜、显微镜、望远镜等仪器，或利用照相机、摄像机、录音机等工具，有时还需要测量。科学观察要有明确的目的，观察要全面、细致和实事求是。

二、调查的步骤

①明确调查目的；②确定调查对象；③制定合理的调查方案；④调查记录；⑤对调查结果进行整理和分析；⑥撰写调查报告。

三、生物的分类

按照形态结构特点分动物、植物、其他生物

按照生活环境分陆生生物、水生生物

按照用途分作物、家禽、家畜、宠物

四、了解生物圈

地球上所有的生物与其环境的总和就叫生物圈。

一、生物与环境的关系

1、生物的生活环境不仅是指生物的生存空间，还包括存在于它周围的各种影响因素。

环境中影响生物的生活和分布的因素叫做生态因素。生态因素可分为两类：

（1）非生物因素：光、水分、温度等。

（2）生物因素：影响某种生物生活的其他生物。

最常见的是捕食关系，还有竞争关系、合作关系、寄生关系

2、探究的过程：1、提出问题2、作出假设3、制定计划4、实施计划5、得出结论6、表达和交流

对照实验：在研究一种条件对研究对象的影响时，所进行的除了这种条件不同以外，其他条件都相同的实验，叫做“对照实验”。

3、环境对生物的影响

4、生物对环境的适应和影响

生物对环境的适应的例子（P.17）

生物对环境的影响：植物的蒸腾作用调节空气湿度、植物的枯叶枯枝腐烂后可调节土壤肥力、动物粪便改良土壤、蚯蚓松土

生物在适应环境的同时，也影响和改变着环境。

二、生物与环境组成生态系统

1、生态系统的概念：在一定的空间范围内，生物与环境所形成的统一整体叫生态系统。一片森林，一块农田，一片草原，一个湖泊，等都可以看作一个生态系统。

2、生态系统的组成：

生物部分生产者、消费者、分解者

非生物部分阳光、水、空气、温度

3、植物是生态系统中的生产者，动物是生态系统中的消费者，细菌和真菌是生态系统中的分解者。生态系统中在一般情况下数量的应该是生产者。

4、食物链和食物网：

在生态系统中，不同生物之间由于吃与被吃的关系而形成的链状结构叫做食物链。

在一个生态系统中，往往有很多条食物链，它们彼此交错连接，形成食物网

①生态系统中的物质和能量是沿着食物链和食物网流动的；

②食物链的起始环节是生产者，终点为消费者，且是不被其他动物捕食的动物；

③营养级越高，生物数量越少；

④有毒物质沿食物链积累，营养级别越高的生物，体内有毒物质积累的越多。

5、生态系统具有一定的自动调节能力

在一般情况下，生态系统中生物的数量和所占比例是相对稳定的。这说明生态系统具有一定的自动调节的能力。但这种自动调节能力有一定限度，超过则会遭到破坏。

三、生物圈是的生态系统

1、生物圈的范围：

大气圈的底部：可飞翔的鸟类、昆虫、细菌等

水圈的大部：距海平面150米内的水层

岩石圈的表面：是一切陆生生物的“立足点”

2、生物圈为生物的生存提供了基本条件：

营养物质、阳光、空气和水、适宜的温度和一定的生存空间

3、生态系统的类型：森林生态系统、草原生态系统、湿地生态系统、淡水生态系统、农田生态系统、海洋生态系统、城市生态系统等。

4、生物圈是一个统一的整体（P.30）

生物圈是一个统一的整体，是地球上的生态系统，是所有生物共同的家园。

第二单元生物体的结构层次

第一章细胞是生命活动的基本单位

一、练习使用显微镜

1、显微镜的构造

镜座：稳定镜身；

镜柱：支持镜柱以上的部分；

镜臂：握镜的部位；

载物台：放置玻片标本的地方。中央有通光孔，两旁各有一个压片夹，用于固定所观察的物体。

遮光器：上面有大小不等的圆孔，叫光圈，每个光圈都可以对准通光孔，用来调节光线的强弱。

反光镜：可以转动，使光线经过通光孔反射上来。其两面是不同的：光强时使用平面镜，光弱时使用凹面镜。

镜筒：上端装目镜，下端有转换器，在转换器上装有物镜，后方有准焦螺旋。

准焦螺旋：①粗准焦螺旋：转动时镜筒升降的幅度大；

②细准焦螺旋：转动时镜筒升降的幅度很小。

转动方向和升降方向的关系：顺时针转动准焦螺旋，镜筒下降；反之则上升

2、、显微镜的使用

方法步骤：（1）取镜和安放（2）对光（3）观察（4）练习（5）收镜装箱

1、从目镜内看到的物像是倒像，观察的物像与实际图像相反。注意玻片的移动方向和视野中物象的移动方向相反。放大倍数越大，观察到的物像就越大，但观察的视野范围就越小。

2、放大倍数＝物镜倍数×目镜倍数

3、在显微镜下观察的生物标本，应该薄而透明，光线能透过，才能观察清楚。因此必须制成玻片标本

4、英国物理学家罗伯特.虎克观察软木薄片，发现了细胞。

二、植物细胞

1、常用的玻片标本：切片、涂片、装片的区别（P.42）

2、植物细胞的基本结构的作用（P.45）

①细胞壁：支持、保护

②细胞膜：控制物质的进出，保护

③细胞质：液态的，可以流动的。

④细胞核：贮存和传递遗传信息

⑤叶绿体：进行光合作用的场所

⑥液泡：在细胞质中，含有细胞液，溶解着多种物质

3、植物洋葱表皮细胞临时装片的制作过程

擦滴（清水）撕展盖染吸

4、液泡内的细胞液中溶解着多种物质。细胞质里叶绿体和线粒体。

三、动物细胞

1、动物细胞的结构（P.47—P.48）

细胞膜：控制物质的进出

细胞核：贮存和传递遗传信息

细胞质：液态，可以流动

制作观察人的口腔上皮细胞临时装片（擦滴（生理盐水0.9％）刮涂盖染吸）

3、植物细胞与动物细胞的相同点：都有细胞膜、细胞质、细胞核

植物细胞与动物细胞的不同点：植物细胞有细胞壁、叶绿体和液泡，动物细胞没有。

德国生物学家施莱登和施旺共同创建了“细胞学说”，恩格斯将细胞学说、能量转化与守恒定律、

达尔文的进化论并列为19世纪自然科学的三大发现。

四、细胞的生活

细胞是构成生物体的结构和功能的基本单位。

1、细胞中的物质分为两大类：

有机物（一般含碳，可燃烧）：如糖类、脂类、蛋白质、核酸，这些都是大分子

无机物（一般不含碳,不燃烧）：如水、无机物、氧等，这些都是分子比较小

2、细胞膜控制物质的进出，对物质有选择性，需要的物质进入细胞，细胞生活中产生的一些不需要或

有害的物质通过细胞膜排出。

3、植物叶片细胞含有叶绿体，叶绿体中的色素能够吸收光能。叶绿体可将光能转变成化学能，并将化学能储存在它所制造的糖类等有机物中。线粒体可以使细胞中的一些有机物，通过复杂的变化，将其中储存的化学能释放出来，供细胞利用。

4、细胞内的能量转换器：线粒体和叶绿体

叶绿体：进行光合作用，把二氧化碳和水合成有机物，并产生氧。

线粒体：进行呼吸作用，是细胞内的“动力工厂”、“发动机”。

二者联系：都是细胞中的能量转换器

二者区别：叶绿体将光能转变成化学能储存在有机物中；线粒体分解有机物，将有机物中储存的化学能释放出来供细胞利用。

5、动植物细胞都有线粒体。

6、细胞核是控制中心遗传信息库，遗传信息存在于细胞核中

1、多莉羊的例子（P.53）说明，细胞核控制着生物的发育和遗传

2、细胞核中的遗传信息的载体——DNA（脱氧核糖核酸），DNA上有指导生物发育的全部信息。

3、细胞的生活是物质、能量和信息变化的统一

第二章细胞怎样构成生物体

一、细胞通过分裂产生新细胞

1、生物的由小长大是由于：细胞的生长、分裂和分化分不开

2、细胞分裂的过程：（P.57）就是一个细胞分成两个细胞

①细胞核先由一个分成两个②细胞质分成两份③植物细胞：在原细胞中央形成新的细胞膜和细胞壁，分裂为两个细胞

动物细胞：细胞膜从细胞中部向内凹陷，溢裂为两个新细胞④

3、细胞中那些被碱性染料染成深色的物质称作染色体。染色体是由DNA和蛋白质组成的，DNA是遗传物质，因此可以说染色体就是遗传物质的载体。在细胞分裂过程中，染色体变化最为明显，在细胞分裂的不同时期其形态不同。在细胞分裂时，染色体会进行复制。分裂后的两个新细胞染色体形态和数目相同。新细胞与原细胞的染色体形态和数目也相同。染色体数量要保持恒定，否则会有严重的遗传病。

二、动物体结构层次

动物和人体的发育都是从一个细胞受精卵开始的，通过细胞分裂产生新细胞。

在个体发育过程中，一个或一种细胞通过分裂产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生差异性的变化，这个过程叫做细胞分化。

由形态相似、结构、功能相同的细胞联合在一起形成的细胞群叫做组织。

多细胞生物体都是通过细胞分裂增加细胞数目，经过细胞生长和分化形成了生物体内多种多样的细胞，这些细胞进一步形成组织。

动物和人的四种基本组织：上皮组织、肌肉组织、结缔组织、神经组织。（作用和分布P.60）

由不同的组织按照一定的次序结合在一起构成的行使一定功能的结构，形成器管

能够共同完成一种或几种生理功能的多个器官按照一定的次序组合在一起构成系统。

系统：运动系统、消化系统、呼吸系统、循环系统、泌尿系统，神经系统、内分泌系统、

生殖系统。

9、动物和人的基本结构层次（小到大）：细胞—组织—器官—系统—动物体和人体

三、植物体结构层次

1、植物体发育从受精卵开始，经过细胞分裂、分化，形成组织、器官，进而形成植物体。

2、绿色开花植物的六大器官：根、茎、叶、花、果实、种子（P.63）

营养器官：根、茎、叶；生殖器官：花、果实、种子

3、植物的组织：分生组织、保护组织、营养组织、输导组织、机械组织等

4、对植物体的结构层次，从宏观到微观可以这样描述：植物体是由六大器官组成的；每一种器官都由几种不同的组织构成；每一种组织都由形态相似、结构和功能相同的细胞联合在一起形成。

5、植物结构层次（从微观到宏观）：细胞—组织—器官—植物体。

四、单细胞生物

1、单细胞生物：身体只有一个细胞，大多数单细胞生物生活在水域

或湿润的环境中。

1、单细胞生物：草履虫、酵母菌、衣藻、变形虫、大肠杆菌、眼虫P.66页

2、草履虫的结构（P.70图Ⅱ-24）

3、单细胞生物与人类的关系：有益也有害

益处：①鱼类的天然饵料；②净化污水（如疟原虫、痢疾内变形虫等）

害处：①引发疾病；②形成赤潮

第三单元生物圈中的绿色植物

第一章生物圈中有哪些绿色植物

一、藻类、苔藓、蕨类植物

1、藻类植物的主要特征：结构简单，有单细胞，也有多细胞，有的生活在淡水中，有的生活在海水中。没有根、茎、叶等器官的分化；细胞里有叶绿体，能进行光合作用。

2、藻类植物通过光合作用制造的有机物可以作为鱼的饵料，放出的氧气除供鱼类呼吸外，还是大气中氧气的重要来源。海带、紫菜、海白菜等可食用，从藻类植物中提取的碘、褐藻胶、琼脂等可供工业、医药上使用

2、苔藓植物大多生活在陆地上的潮湿环境中。

苔藓植物一般都很矮小，通常具有类似茎和叶的分化，但是茎中没有导管，叶中也没有叶脉，根非常简单，称为假根。根不能吸收水分，也不能不能运输水分和无机盐，所以苔藓植物的生命活动不能离开水。

苔藓植物密集生长，植株之间的缝隙能够涵蓄水分，所以，成片的苔藓植物对林地、山野的水土保持具有一定的作用。

苔藓植物的叶只有一层细胞，二氧化硫等有毒气体可以从背腹两面侵入细胞，从而威胁它的生存。人们利用这个特点，把苔藓植物当作监测空气污染程度的指示植物。

3、蕨类植物有根、茎、叶等器官的分化，而且还具有专门运输物质的通道——输导组织。蕨类植物不结种子，它的叶片背面有孢子囊群，可产生孢子，孢子是一种生殖细胞，在温暖潮湿的地方萌发和生长。

蕨类植物的经济意义在于：①有些可食用；②有些可供药用；③有些可供观赏；④有些可作为优良的绿肥和饲料；⑤古代的蕨类植物的遗体经过漫长的年代，变成了煤。

二、种子植物

1、种子的结构

菜豆种子：种皮、胚{胚芽、胚轴、胚根、子叶（2片）}

玉米种子：果皮和种皮、胚、子叶（1片）、胚乳

种皮可以保护里面幼嫩的胚。胚是新植物体的幼体，

由胚芽、胚轴、胚根和子叶组成。有的种子还有胚乳。

子叶和胚乳里有营养物质，供给胚发育成幼苗。

种子植物比苔藓、蕨类更适应陆地的生活，其中一个重要的原因是能产生种子。

种子植物包括两大类群：裸子植物和被子植物。

种子是裸露着的称为裸子植物；

种子外面有果皮包被着的植物称为被子植物（绿色开花植物）。

记住常见的裸子植物和被子植物（P.84页）

第二章被子植物的一生

被子植物的一生，要经历种子的萌发，植株的生长、发育、繁殖、

衰老和死亡的过程。

一、种子的萌发

1、种子的萌发环境条件：适宜的温度、一定的水分、充足的空气

自身条件：具有完整的有生命力的胚，已度过休眠期。

3、种子萌发的过程

吸收水分—营养物质转运—胚根发育成根，胚轴伸长，胚芽发育成芽，芽进一步发育成茎和叶。

（注意：首先突破种皮的是胚根，食用豆芽的白胖部分是由胚轴发育来的）

3、测定种子的发芽率（会计算）和抽样检测（P.93.94页）

抽样检测：是指从检测对象中抽取少量个体作为样本进行检测。

二、植株的生长

1、从根的顶端到生有根毛的一小段，叫做根尖。根尖是幼根生长最快的部位。

2、根尖的结构（从上到下）：根冠、分生区、伸长区、成熟区。

4、幼根的生长

根生长最快的部位是：根尖的伸长区。成熟区的表皮上有根毛，根毛是吸收水分和无机盐的主要部位

幼根的生长一方面靠分生区细胞的分裂增加细胞的数量，一方面要靠伸长区细胞体积的增大。

5、枝条是由芽发育成的。幼叶发育成叶，芽轴发育成茎，芽原基发育成芽。植株的芽按照着生位置可分为顶芽和侧芽。芽中有分生组织，芽在发育时，分生组织的细胞分裂和分化，形成新的枝条。枝条是由幼嫩的茎、叶、芽组成的。

年轮反映了茎加粗生长的过程，加粗生长是茎的形成层细胞不断分裂和分化的结果。

6、根向下生长，从土壤中吸收水和无机盐，茎向上生长，并长出绿叶，通过光合作用制造有机物。

肥料的作用主要是给植物的生长提供无机盐。植株生长需要的营养物质：水、无机盐、有机物

植物生长需要做多的无机盐是：氮、磷、钾（缺乏症P.99页）。

缺硼的无机盐，油菜只开花不结果。

7、植物在不同时期需水量不同，同一植物的不同生长发育时期需水量也有很大差异

三、开花和结果

1、花的结构：（P.104页）

2、一朵花由花托、萼片、花瓣、雌蕊和雄蕊等组成

3、花的主要结构是雄蕊和雌蕊，雄蕊花药

里面有花粉，雌蕊下部的子房里有胚珠。

4、传粉和受精（P.104105页）

传粉：发育、花粉从花药中散放而落到雌蕊柱头

上的过程，叫做传粉

植物传粉的类型：自花传粉和异花传粉

胚珠里面的卵细胞与来自花粉管中的结合，形成受精卵的过程，称为受精。

5、一朵花的花粉，从花药散放出后，落到同一朵花的柱头上的传粉现象，叫做自花传粉。如小麦水稻

花粉依靠外力落到另一朵花的柱头上的传粉方式，叫做异花传粉。传粉的媒介主要是风和昆虫。

6、果实和种子的形成：子房发育成果实子房壁发育成果皮胚珠发育成种子受精卵发育成胚

7、人工辅助授粉当传粉不足的时候可以人工辅助受粉。

第三章绿色植物与生物圈的水循环

一、植物对水分的吸收和运输

1、根吸水的部位主要是根尖的成熟区，成熟区有大量的根毛。（意义：成熟区大量的根毛，使得根尖具有巨大的吸收面积，因而具有较强的吸水能力）

2、在根、茎、叶脉中有导管，它属于输导组织。所有的导管相互连接在一起，形成了水分运输的管网，根吸收的水和溶解在水中的无机盐通过这个管网被送到植物体的各个部分。

3、水分从活的植物体表面以水蒸气状态散失到大气中的

过程，叫做蒸腾作用。植物体内的水分是通过蒸腾作用

散失的。蒸腾作用主要是通过叶片进行的。

4、叶片的结构：表皮（上表皮和下表皮）、叶肉、叶脉组成。

表皮是由一层细胞组成的，在表皮上分布有气孔。气孔是植物

蒸腾作用的“门户”，也是气体交换的“窗口”，它是由一对半月形

细胞——保卫细胞围成的空腔。保卫细胞吸水膨胀，气孔张开；

保卫细胞失水收缩，气孔关闭。白天气孔张开，晚上气孔闭合。

5、蒸腾作用的意义：

①可降低植物的温度，使植物不至于被灼伤；

②拉动水分和无机盐在体内运输，保证各器官对水和无机盐的需要；

③提高大气湿度，增加降水，促进生物圈水循环。

第四章绿色植物是生物圈中有机物的制造者

1、天竺葵的实验

暗处理：把天竺葵放到黑暗处一夜

（目的：让天竺葵在黑暗中把叶片中的淀粉全部转运和消耗。）

对照实验：将一片叶子的一半的上下面用黑纸片遮盖

（目的：做对照实验，看看照光的部位和不照光的部位是不是都产生淀粉。）

脱色：几个小时后把叶片放进水中隔水加热

（目的：脱色，溶解叶片中叶绿素便于观察。）

染色：用碘液染色。

结论：淀粉遇碘变蓝，可见光部分进行光合作用，制造有机物。

2、凡是植物的绿色部分，只要细胞中含有叶绿体，就都能制造有机物。叶片是绿色植物制造有机物的主要器官

3、光合作用概念：绿色植物通过叶绿素捕获太阳光，利用光提供的能量，在叶绿体中合成淀粉等有机物，并且把光能转变成化学能，储存在有机物中，这个过程叫光合作用。

4、叶绿体既是生产有机物的“车间”，也是将光能转变为化学能的“能量转换器”。

5、植物运输物质的途径：导管：从下往上输送水分和无机盐

筛管：从上往下输送叶片光合作用产生的有机物到植物体各处的细胞，为细胞生命活动提供能量。

6、细胞壁的主要成分是纤维素；细胞膜的主要成分是蛋白质和脂质；细胞核中的DNA也是有机物。

7、光合作用意义：绿色植物通过光合作用制造的有机物，不仅满足自生生长、发育、繁殖的需要，而且为生物圈中其他生物提供了基本的食物来源。

第五章绿色植物与生物圈中的碳-氧平衡

一、光合作用吸收二氧化碳释放氧气

1、绿色植物通过光合作用制造有机物时，从外界吸收二氧化碳并释放出氧气。

2、了解英国科学家普利斯特利得经典实验（P.122页）

4、光合作用实质：绿色植物通过叶绿体，利用光能，把二氧化碳和水转化成储存能量的有机物（如淀粉），并且释放出氧气的过程。（光合作用示意图是重点P.124页）

5、光合作用与生产生活关系：

①要保证农作物有效地进行光合作用的各种条件，尤其是光。

②合理密植，使作物的叶片充分地接受光照。

二、绿色植物的呼吸作用

1、有机物在彻底分解时不仅产生二氧化碳，还产生水。二氧化碳具有使澄清的石灰水变浑浊的特性来检验种子萌发时是否放出了二氧化碳。

2、、呼吸作用的概念：细胞利用氧，将有机物分解成二氧化碳和水，并且将储存在有机物中的能量释放出来，供给生命活动的需要，这个过程叫呼吸作用。

（原料）（场所）（产物）

3、呼吸作用是生物的共同特征，呼吸作用主要是在线粒体内进行，其实质就是有机物分解，释放能量。

4、呼吸作用意义：呼吸作用释放出来的能量，一部分是植物进行各项生命活动（如：细胞分裂、吸收无机盐、运输有机物等）不可缺少的动力，一部分转变成热量散发出去。

5、绿色植物通过光合作用，能不断消耗大气中的二氧化碳，有将产生的氧气排放到大气中，对维持生物圈中二氧化碳和氧气的相对平衡（简称碳-氧平衡）起到了重要作用。

2、呼吸作用与生产生活的关系：

①适时松土、及时排涝都是为了使空气流通，以利于植物根部进行呼吸作用；

②植物的呼吸作用要分解有机物，因此在储存植物的种子或其他器官时，要设法降低呼吸作用的强度，保持干燥和低温、减少含水量、降低氧气浓度、增大二氧化碳浓度等都可抑制呼吸作用。

4、光合作用和呼吸作用的区别和联系

光合作用呼吸作用

部位叶绿体线粒体

条件光有光、无光均可

原料二氧化碳、水有机物、氧气

产物有机物、氧气二氧化碳、水

能量变化储存能量释放能量

第六章爱护植被，绿化祖国

一个地区内生长的所有植物叫做这个地区的植被。

1、我国主要的植被类型：草原、荒漠、热带雨林、常绿阔叶林、落叶阔叶林、针叶林

2、我国植被面临的主要问题：

①植被覆盖率低；②对森林资源利用不够合理，伐优留劣，乱砍滥伐；③过度放牧使草场退化、沙化。

篇11

生物素（biotin），是动物机体内维持正常生理机能所必需的维生素之一。由于生物素广泛分布于动植物中，在食物中分布较为广泛，而且动物肠道菌群能够合成生物素，因此，过去人们曾经认为食物中不会缺乏生物素。但是，由于人类科技的迅速发展，生活水平的不断提高，吃的食物越来越精细化，经常出现了生物素缺乏症的案例。尤其是那些爱吃在集约化条件下生产的快餐、方便面等加工食品的人群，更容易出现生物素缺乏症状。于是，人们开始重新审视和研究生物素的营养作用。近年来，生物素已成为人们最受关注的水溶性维生素之一。

一、生物素的化学结构和分子作用机制

生物素的化学结构中包括具有尿素与噻吩相结合成骈环的两个五元杂环，和一个带有五个碳原子的羧基侧链组成。天然的生物素主要以与其它分子结合的形式存在，在体内由侧链上的五个碳原子羧基与酶蛋白的赖氨酸s残基结合，发挥辅酶作用。生物素有8种不同的异构体，其中只有D-生物素具有生物活性。在一般情况下，生物素是相当稳定的，只有在强酸、强碱、甲醛、败脂肪、胆碱及紫外线照射才会逐渐被破坏。生物素是许多需ATP的羧化反应中羧基的载体，羧基暂时与生物素双环系统上的一个氮原子结合，如在丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的反应中。动物缺乏生物素会引起皮肤疾病和脱毛症。鸡蛋清蛋白含有能与生物素紧密结合的抗生物素蛋白，如果大量食用生鸡蛋，就会妨碍生物素的吸收，可导致人类生物素缺乏症。在正常情况下，人类肠道细菌合成的生物素可以满足人体正常新陈代谢的需要，不会发生生物素缺乏症。在生物体内，它几乎都是作为生物素酶的辅基与蛋白质的赖氨酸的ε-氨基形成共价键。其生理作用主要是由生物素酶引起的固碳作用及羧基转移反应。通过丙酰辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酸单酰CoA羧基转移酶等反应，参与糖和脂肪的代谢。在这些酶促反应中形成的N-羧基生物素作为中间产物。

生物素是羧化和羧基转移酶系的辅酶，是羧基转用的载体，这些酶系在细胞中有转移羧基和固定二氧化碳的作用。具体分子作用机制表现在：1、生物素作为丙酮酸羧化酶的辅酶，通过糖异生作用，从丙酮酸到丁酮二酸生成葡萄糖；2、当乙酰辅酶A被乙酰辅酶羧化酶产生丙二酸单酰辅酶A的时候，生物素作为乙酰辅酶A羧化酶成分起作用。消耗三磷酸腺苷ATP而生成羧基生物素中间体，然后将活性二氧化碳提供给乙酰辅酶A，生成丙二酸单酰辅酶A，这是脂肪酸合成的首步反应，再与一分子乙酰辅酶A结合，经脱羧，还原和去水后，被转化为丁酰辅酶A。这个衍生物经过反复合成，最终形成长链脂肪酸（硬脂酸、棕榈酸）。在长链不饱和脂肪酸合成过程中，尤其是必需脂肪酸代谢中，生物素是十分重要。3、在碳水化合物供给不足时，从脂肪和蛋白质生成葡萄糖的糖原异生作用中，生物素都起着重要的作用，三羧酸循环也离不开它；氨基酸代谢中，直接参与亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸的脱氨基及核酸代谢，蛋氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙酰辅酶A羧化酶（生物素酶）的作用，经琥珀酰辅酶A进入柠檬酸循环。4、其他作用，氨基甲酰转移、嘌呤合成、糖代谢、色氨酸分解等，生物素还通过其对核糖核酸的性质和合成速度的作用，而影响蛋白质的合成。5、生物素可以使肝脏鸟氨酸转甲氨酰酶活性及其mRNA丰度升高，鸟氨酸转甲氨酰酶在精氨酸代谢和尿素循环中起着很重要的作用。

二、生物素影响基因表达的作用机理

目前，已经发现生物素影响基因表达的主要途径有3条：1、生物素酰腺苷酸能够激活可溶性鸟苷酸环化酶；2、生物素能够影响细胞核因子与其他转录因子的活性；3、生物素与组蛋白结合对染色体的重组的影响。

DNA芯片研究表明，生物素对外周血液单核细胞的200多个基因表达有影响。生物素在蛋白质合成、氨基酸脱羧、嘌呤合成、氨基甲酰转移及亮氨酸和色氨酸分解代谢中起着重要作用，也是多种氨基酸转移脱羧所必需。 生物素不仅参与羧化酶代谢途径，而且影响基因表达，动物缺乏生物素将导致细胞增殖减缓，免疫功能受损和胚胎发育畸形。

1、生物素酰腺苷酸。生物素酰腺苷酸是羧化全酶合成过程中的中间产物，生物素酰腺苷酸的合成是由羧化全酶合成酶催化的，生物素酰腺苷酸是通过一种目前尚不清楚的作用机理对可溶性鸟苷酸环化酶进行活化。鸟酸环化酶的活化使环鸟苷酸量增加，从而刺激蛋白激酶G产生信号传导，蛋白磷酸化得到活化，使编码羧化全酶合成酶、乙酰-CoA羧化酶，丙酰-CoA羧化酶基因转录活性增强。如果生物素缺乏或羧化全酶合成酶的活性降低这些基因的转录活性将受阻碍。在大肠杆菌和其他肠道细菌中，有一族基因参与生物素的合成，生物素酰腺苷酸与生物素蛋白连接酶形成复合物，复合物结合在生物素操纵子的启动子区域，通过反馈调节抑制这些基因表达。

2、细胞核因子与其他转录因子。细胞核因子在参与调节，防止细胞死亡和胚胎发育等过程起着重要的作用。哺乳动物NF-kB、Rel家族已经有五个转录因子被克隆和测序。其作用机理：细胞未受刺激时NF-kB家族蛋白以二聚体的形式存在，单体IkBα或者IkBβ使该二聚体活性受到抑制，NF-kB与IkB结合后滞留在细胞质中，IkB激酶受到细菌、细胞因子、有丝分裂原、生长因子和激素等刺激后引发IkBs磷酸化，之后在蛋白酶体依赖性途径中降解；被释放的NF-kB二聚体移位到细胞核中，结合在基因调控区域的反应元件从而引发基因表达。

3、组蛋白的生物素酰化。染色质包括DNA、组蛋白和非组蛋白，DNA的折叠进入染色质主要由组蛋白起作用。组蛋白可以通过乙酰化、甲基化、磷酸化、泛蛋白化等共价修饰。研究发现人体细胞含有生物素酰化的组蛋白。Stanley等通过酸提取的方法在人体外周血液单核细胞细胞核中分离出了生物素酰化的组蛋白。在人体T细胞白血病细胞系、细小细胞肺癌细胞、人绒膜癌细胞和鸡红血球细胞等也发现有生物素酰化组蛋白，组蛋白的生物素酰化对细胞增殖起着很重要的作用；组蛋白的生物素酰化可以促进人体外周血液单核细胞的增殖。但与生物素酰化组蛋白相关的基因是否被激活或沉默以及生物素酰化组蛋白是否参与DNA修复尚不清楚。最近研究发现，在紫外诱导的DNA损伤的细胞中生物素酰化蛋白量较高，推测生物素酰化组蛋白可能参与DNA损伤的修复。

本文通过生物素对人体基因表达主要途径影响以及生物素是以多种酶的辅助因子形式参与人体许多的新陈代谢过程的研究，阐明了生物素是人体维持正常生理机能所不可或缺一种维生素。

参考文献

篇12

中图分类号：S482.292 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170133026

植物抑菌剂是一种安全性能较高的天然抑菌剂，较之其他的人工合成抑菌剂而言具有突出的病原微生物抑制作用，清除微生物自由基，延长产品保质期限，有待更为深入的潜能开发。但是由于植物抑菌剂自身特性，内部活性成分十分复杂，当前研究中关于植物抑菌剂的抑菌机理研究尚不完善，未能广泛推广和应用。加强植物抑菌剂抑菌机理的研究方法进展分析是十分有必要的，有助于丰富理论研究，为实践工作开展提供参考依据。

1 抑菌剂对细胞壁作用的研究方法

1.1 细胞壁成分分析

为了深入分析抑菌剂对细胞壁的影响，主要取决于细胞壁的成分变化，以此来观察抑菌剂的具体作用。微生物细胞壁中的成分含量较为复杂，主要包括磷壁酸、蛋白质和肽聚糖，作为微生物外部的一层保护膜，有助于维持微生物的生命活力，阻拦有害物质进入细胞，同细胞膜共同实现物质交换。脂多糖作为革兰氏阴性细菌细胞壁中重要组成部分，能够有效阻拦微生物对疏水性抗生素的吸收，如果外部环境不利于细胞生长时，对菌体可以起到保护作用，但是酚类抗菌物质仍然会破坏革兰氏阴性细菌内部结构，从而起到渗透作用[1]。

1.2 碱性磷酸酶

碱性磷酸酶是生长于细胞壁和细胞膜之中的成分，在一般情况下，细胞外难以检查到碱性磷酸酶活性。但是，如果细胞壁结构被破坏，渗透性能增加，酶将泄露出来。故此，通过在培养液中观察酶的变化来分析微生物细胞壁的完整性，是当前较为常见的一种方法。

2 研究对细胞膜作用机制的技术手段

细胞膜是保持细胞完整性的物质能量代谢基础。在相关研究中不难看出，多种植物源防腐剂可以在细胞壁和细胞膜体系中发生作用，破坏细胞膜结构，从而提高细胞的渗透性能，促使营养物质可以正常的进入细胞膜，抑制微生物的生长。AHMAD等在研究植物抑菌剂对细胞膜作用机制研究中，傅里叶利用远红外光谱及DSC技术观察抗菌肽是否能够诱导生物膜PG/PE脂质混合物分层。通过大量的研究结果表明，壳聚糖能够有效提升细胞膜的渗透性能，破坏微生物细胞膜内部结构，从而影响到细胞膜的完整性，抑制微生物的正常生长。

3 研究抑菌剂对微生物呼吸影响的方法

3.1 呼吸代谢抑制试验

呼吸代谢抑制试验中，可以初步判断出抑菌物质对于微生物呼吸代谢产生的影响，以抑菌剂的叠加率为依据进行判断，能够发现叠加率越小，相伴随的与抑制剂之间产生的增效作用越弱，起到抑制微生物呼吸代谢的作用，抑制微生物正常生长。

3.2 Clark氧电极法

Clark氧电极法是极谱分析中一种较为常见的类型，主要是用来检测水中溶解氧成分，在植物抑菌剂抑菌机理研究中应用，可以了解到菌体呼吸作用过程中的氧气变化情况，以此来判断微生物的生长情况。此种方法在实际应用中具有反应快、准确率高的特点，故此在连续监测菌体呼吸代谢作用中，可以通过观察氧气消耗量和快慢指标来分析抑制剂对微生物呼吸代谢所产生的抑制机理。

4 研究抑菌剂对遗传物质影响的方法

植物抑菌剂的主要抑菌机理是作用在遗传物质上。植物抑菌剂可以有效抑制微生物菌体蛋白质生长，逐渐出现凝固现象，可以有效抵制酶催化作用。此外，由于遗传物质自身特性，能够促进蛋白质快速合成，加速新陈代谢，为微生物生长提供必要的营养支持，而植物抑菌剂则起到抑制蛋白质物质的生长，微生物生长受阻，影响菌体细胞壁合成，以此来延长产品的保质期。

5 结论

对抑制菌机理的深入研究，主要取决于研究方法和研究手段，尽管当前理论研究中提出了多种研究方法和技术手段，但是不同的抑菌作用机制视角不同，抑菌机制的研究中需要结合多种技术才能更好的提高研究效果，未来将开发出更高灵敏度、安全性和方便的抑菌机理研究方法。

篇13

2010年秋季，甘肃省全面实施高中新课程。新课程标准下的高中生物与旧课程相比，更强调了探究能力的培养，要求全面提高学生的生物科学素养。主要的思路是沿着科学家们对生物学的认识过程来呈现知识内容，使学生体会探究的乐趣。树立正确的生物学观点是学习生物学、提高学生科学素质的重要目标之一，是生物新课程改革的一个基本要求；正确的生物学观点又是学习、研究生物学的有力武器。

一、生命的物质性观点

生物具有共同的物质基础，即组成生物体的化学元素和化合物基本相同。组成生物体的化学元素有二十多种，它们在生物体内的含量不同。含量占生物体总质量的万分之一以上的元素称大量元素，如C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg等。生物生活所必需，但是需要量却很少的一些元素，称微量元素，如Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo等。这些化学元素对生物体都有重要作用。组成生物体的二十多种化学元素，在无机自然界都可以找到，没有一种化学元素是生物所特有的。这个事实说明，生物界和非生物界具有统一性。生命的物质性观点能帮助我们理解生物界与无机自然界的统一性以及生物的进化历程。

二、生物结构与功能相统一的观点

生物体的结构与功能相适应。结构与功能相统一的观点包括两层意思：一是有一定的结构就必然有与之相对应功能的存在；二是任何功能都需要一定的结构来完成。例如C3植物和C4植物的叶片结构与其功能相适应：C3植物的维管束鞘细胞不含叶绿体，叶肉细胞含有正常叶绿体；C4植物的维管束鞘细胞含没有基粒的叶绿体，叶肉细胞则含有正常的叶绿体。所以C3植物的叶肉细胞中进行光合作用的光反应以及暗反应的C3途径，C4植物的叶肉细胞既进行光反应又进行暗反应的C4途径，而维管束鞘细胞只进行暗反应的C3途径，因此，C3植物光合作用产物淀粉存在于叶肉细胞，而C4植物光合作用产物淀粉则存在于维管束鞘细胞中。

三、生物的整体性观点

系统论有一个重要的思想，就是整体大于各部分之和，这一思想也完全适合生物领域。不论是细胞水平、组织水平、器官水平还是个体水平，甚至包括种群水平和群落水平，都体现出整体性的特点。例如生物体的结构基础――细胞，其亚显微结构中的细胞膜、核膜以及线粒体、叶绿体、内质网、核糖体、高尔基体、中心体、液泡、溶酶体等细胞器都有其特有的结构和功能，但是只有在它们组成一个整体――细胞的时候才能完成新陈代谢等生命活动，这就是细胞结构的完整性。若从结构上看，生物膜不仅具有直接的联系，而且具有间接的联系，即生物膜之间可以相互转化；从功能上看，细胞的各部分结构既有明确的分工，又有紧密的联系，协调一致地共同完成各项生命活动。从调控上看，细胞核是遗传物质储存、复制和转录的场所，是细胞遗传和代谢的控制中心，在遗传物质的调控下细胞成为一个统一的整体。从与外界环境的关系上看，细胞的整体性还表现在每一个细胞都要与相邻细胞进行物质交换和能量交换，而与外界直接接触的细胞都要与外界环境进行物质交换和能量转换。

四、生命活动对立统一的观点

生物的诸多生命活动之间都有一定的关系，有的甚至具有对立统一的关系。例如，植物的光合作用和呼吸作用、同化作用与异化作用就是对立统一的生命活动。光合作用的实质是合成有机物，储存能量；呼吸作用的实质是分解有机物，释放能量。很明显，两者之间是相互对立的。呼吸作用所分解的有机物正是光合作用的产物，可以说，如果没有光合作用，呼吸作用就无法进行；另一方面，光合作用过程中，原料和产物的运输所需要的能量，也正是呼吸作用释放出来的，如果没有呼吸作用，光合作用也无法进行。因此说，呼吸作用和光合作用又是相互联系、相互依存的。只有光合作用和呼吸作用的共同存在，才能使植物体的生命活动正常进行。

五、生物进化的观点