基因治疗的策略范文
发布时间：2023-09-26 14:44:00
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篇1
急性期
全身治疗 可全身应用抗生素控制感染，服用止痛剂。
局部治疗
外耳道肿胀渗液较甚者，可用5%～8%醋酸铝纱条敷塞外耳道，并嘱患者每隔3～4小时自行滴入上述药液，每天更换纱条，有收敛消炎作用，可促使干燥。或用2%～5%硝酸银液涂布。或选用抗生素与类固醇激素合剂、糊剂或霜剂局部应用。
每次换药时彻底清除外耳道脓液及脱落上皮，但禁止在局部作过多过重的机械性摩擦，以免损伤外耳道皮肤。
可加用小功率超短波治疗。机制：①改善局部微循环及淋巴循环，使病变部位的白细胞和抗体增加，炎性反应迅速局限化，病理产物、细菌毒素得以清除；②增强白细胞吞噬能力，抑制自由基产生，激活机体应激反应，增强机体免疫力；③促进炎性反应组织中钙离子增加，钾离子减少，降低组织兴奋性，炎性渗出液减少；④扩张微循环，有利于炎性渗出液的重吸收；⑤使局部环境改变，不利于细菌的生长和繁殖等，而使炎性反应好转。
慢性期
局部治疗
局部应用抗生素(如多黏菌素、新霉素等)与激素类(如强的松龙、地塞米松等)合剂、霜剂、粉剂等换药、涂敷或吹入。
积极治疗感染病灶，如化脓性中耳炎。
因本病导致外耳道狭窄及闭锁而影响耵聍排除及听力者，可在炎症痊愈后行外耳道成形术。
全身治疗 加强全身某些有关疾病的诊治，如贫血、维生素缺乏症、内分泌紊乱、糖尿病。全身辅以维生素A治疗，并注意排除药物过敏因素。
外耳道真菌病
治疗原发病 积极治疗糖尿病、慢性消耗性疾病、肢体癣病等。目前，2型糖尿病的发病率较高，常合并感染，特别是真菌感染，且易反复发作，不易治愈。因此，应建议中老年外耳道真菌病患者进行常规空腹血糖及尿糖检查。在内科系统治疗、控制血糖的同时，局部抗真菌治疗。
局部治疗
消毒生理盐水清洗真菌团块及痂皮，干棉签拭干，局部涂擦达克灵霜或霉克软膏或制霉菌素软膏、溶液或1%两性霉素B软膏等抗真菌药物。如鼓膜有穿孔，注意勿将药物误涂至鼓膜黏膜上。
正确使用抗生素、激素，应认识到局部使用抗生素亦可使局部微生物环境平衡破坏而导致真菌感染。
外耳道皮肤肿胀，渗液时，于清除耵聍残屑及痂皮后，可向外耳道内置入5%醋酸铅溶液的小棉条1根，每天更换1～2次。
保持外耳道皮肤干燥。
戒除挖耳习惯。
全身治疗
重症者全身应用抗真菌药物。
外耳湿疹
防治湿疹的注意事项 少食辛辣刺激性食物，克服挖耳道的不良习惯，保持皮肤干净，忌搔抓，局部忌用肥皂或热水清洗，急性、亚急性期间暂缓预防接种。治疗要及时并要持之以恒。
局部治疗依“湿以湿治、干以干治”的原则。
干燥无渗出液者：涂用1%～2%龙胆紫糊、10%氧化锌软膏、白降汞软膏、抗生素可的松软膏等，保护创面，以便结痂脱落愈合。干痂较多时，应用3%双氧水液清洗。皮肤增厚者可试用3%水杨酸软膏，或用局部浅层X线照射。
渗出液较少者：涂擦2%龙胆紫液，干燥后涂龙胆紫糊或氧化锌糊剂。
渗出液较多者：用3%双氧水液或炉甘石洗剂清洗渗出液及痂皮，再用3%硼酸溶液或5%醋酸铝溶液湿敷。
可给予波长650 nm半导体激光耳腔内照射，输出功率20 mW，10分/次，伴有感染者辅以小功率超短波治疗，5～10次为1个疗程。波长650 nm，输出功率20 mW的半导体激光属于低强度激光照射治疗。近年广泛应用于临床治疗，其生物学作用主要有消炎止痛、加速溃疡和伤口愈合等，有临床报告显示照射具有脱敏，使局部渗出减少、干燥、止痛、止痒、消肿作用，对治疗皮肤湿疹有良好的疗效。耳道内病变位置较为深在，采用耳腔内照射疗法，光线可直接作用于病变部位促进血液循环及淋巴回流，调节局部免疫系统功能，加快病变修复过程，从而达到消炎、消肿、止痛、止痒的目的。耳腔内低强度激光照射为一种安全、有效的治疗方法。超短波疗法电极范围覆盖耳道及整个耳郭，透热作用较深，可增强吞噬细胞的吞噬能力，对于感染性病变具有明显抗炎作用。与半导体激光照射联合应用，起到了表面组织及深部组织治疗互补的作用，较之单一疗法的治疗疗效更为明显。
全身治疗①继发感染时，全身和局部应用抗生素。②服用抗过敏药物，如扑尔敏或克敏能、地塞米松等。③渗液特别多时，静脉注射10%葡萄糖酸钙并补充维生素C。
真菌性中耳炎
全身用药依据药敏结果选择伊曲康唑、盐酸特比萘芬、酮康唑、氟康唑等广谱抗真菌药物口服，对于两性霉素、制菌霉素等不良反应较大的药物要慎用。氟康唑是临床最常用的抗真菌药物，具有抗菌谱广、不良反应小、易吸收和能溶入血脑屏障等优点。
局部清理及用药
局部清理分泌物。首先，在诊断上有助于了解病变是否延及鼓膜或鼓膜有无穿孔，从而决定治疗原则；其次，清理分泌物可有效减少真菌的菌丝及孢子，利于药物吸收。用3%的过氧化氢清洗外耳道分泌物能起到协同治疗的作用。
4%硼酸酒精滴耳液滴耳。酒精本身有抗真菌和收敛作用，而硼酸有抑制真菌作用，但对鼓膜有穿孔的乳突根治术后的患者有明显的致痛、致眩晕作用，故该类患者应避免使用。有湿疹史者应用酒精类制剂亦可刺激其发作，故也应避免使用。
氟康唑注射液外用，无刺激性，可用于鼓膜穿孔者，并可防治鼓室内的真菌感染。国外有文献报道对鼓膜有穿孔的耳真菌病，建议用0.5%的咪康唑溶液，其机制相同。
篇2
1肝内胆管结石的病因
1.1肝内胆管的先天性变异肝内胆管结石的形成主要是因为肝内胆管的先天性变异或畸形，变异的胆管近端狭窄而出现远端扩张并存，变异的胆管可以分布在一个肝叶或肝段，也可以同时存在多个肝叶或肝段的跳跃性变异，一般多分布在左肝外叶和右肝后叶，狭窄胆管使胆汁引流不通畅，而远端胆管扩张使胆汁出现淤积，淤积胆汁感染引起结石形成。大量的文献报道肝内胆管结石时，胆流存在细菌感染，这些细菌以肠道菌群为主。肝内胆管的狭窄胆汁淤积是感染的重要原因，同时感染又加重肝内胆管狭窄，狭窄与感染总是与肝内胆管结石伴生。
1.2胆汁的流体力学因素肝内胆管结石在临床上一般多分布在左肝外叶和右肝后叶，这跟肝内胆管在引流胆汁过程的胆汁流体力学分布有关，左肝外叶及右肝后叶的胆汁经过肝内胆管流出过程需要一定压力克服重力影响，使胆汁的流出变得更加困难，从解剖学因素看，这些部位的胆汁流出常常需克服3-5cmH20的重力影响。
1.3其他因素临床上部分病人有家族聚居现象和很容易出现反复复发的特点，家族的聚居现象提示可能有共同的致病基因或致病因素，反复复发也提示生活习惯，生活环境可能是否是致病的因素之一，这些现象还有待进一步研究。
2肝内胆管结石的综合治疗
肝内胆管结石的治疗尽管疗效尚不十分令人满意，但近年来随着医疗技术及器械的发展也取得了长足的进步。但肝内胆管结石的综合治疗与个体化治疗方案大大地推进了肝内胆管结石的治疗进展。
2.1解除病灶肝内胆管结石的致病因素主要是肝内胆管的变异与胆汁的淤积感染，所以肝内胆管是结石形成的土壤，去除致病的胆管是其中最重要的治疗方法。根据肝内胆管结石治疗的十二字方针即“去除病灶，取尽结石，通畅引流”的原则，去除病灶是根本，通过近几十年肝胆外科的发展，对肝脏的解剖学研究也更加精细，肝叶与肝段的切除变得更加安全可靠。据报道肝内胆管结石合并胆管癌的发生率约为4-11%[1]，大多数学者认为结石对胆管的长期刺激也是引起胆管癌的病因。所以，病灶切除后既根除了结石复发的土壤，同时病灶发生恶性病变也起到预防控制的效果[2]。作者认为肝脏切除后经残肝断面与胆总管会师冲洗是必要的一环，它一方面可以确定肝内胆管的通畅程度，同时还减少了结石残渣的残留。三是降低了感染的几率；临床上依据结石的分布部位及分布范围，有时部分结石病灶很难以彻底清除，或清除病灶弊大于利，所以不必要强行清除，如经肝表面切开取石，U管使用等。病灶的清除应遵循安全，有效，彻底的次序。
2.2术中取石器械的使用术中“B”超，术中胆管造影及术中胆道镜，液电碎石仪等的使用在肝内胆管结石手术过程中对结石的分布部位及分布范围做到了更客观，更精确的把握。对手术具有重要的指导意义。尤其是术中胆道镜的使用使残留结石的几率大为降低[3]。这对不能够完全切除病灶的胆管在取尽结石方面得以顺利完成。还可以术后经“T”管窦道取石。对降低胆道残石率有重要意义[4]。经胆道镜对狭窄的胆管进行扩张，使狭窄的胆管得以暂时解除狭窄，其远期效果值得期待。
2.3胆肠吻合的应用近年来，随着胆管功能性解剖的深入研究，胆肠吻合的指征逐渐严格。胆肠吻合在肝内胆管结石的应用应该在肝内胆管狭窄已经解除后，肝门胆管成型的基础上使用[5]。作者认为盲目使用胆肠吻合不仅无助于结石的自然排出，而且会引起反流性胆管炎。反流性胆管炎又造成肝内胆管的狭窄，感染促进结石形成，许多报道胆肠吻合术后病人出现反复感染，同时结石复发率也有明显增加。但胆肠吻合对胆管下段狭窄引起的肝内胆管病变有确切的治疗意义。
3结果
肝内胆管结石（Intrahepatic cholelithiasis，IHL）是指左右肝管分叉部以上的结石，是肝胆外科的常见病。目前治疗方式多种多样，治疗原则以祛除病灶，取尽结石，通畅引流为肝胆外科医生共识，但以其结石残留与复发率高尤其是复杂的IHL成为肝胆外科的治疗难题。近年来，随着医学技术及器械的不断改进，IHL的综合治疗与个体化治疗的理念越来越突出，HIL的残留与复发已经得到了有效的降低。
参考文献
[1]Lee CC，Wu CY.Chen GH What is the impact of coexistence of hepatolithiasis on cholangocarcinoma[J].J Gastroenterol Hepatol，2002，17：1015-1020.
[2]姜立，陈孝平.肝内胆管结石合并肝胆管癌32例分析[J].中国实用外科杂志，2009，6（29）：499-501.
篇3
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.25.015
【Abstract】 Objective To summarize causes and treatment measures for postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics. Methods There were 6 patients with postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics， 1 case among them had postoperative nonunion after first metatarsal distal osteotomy， and the other 5 cases had postoperative nonunion after first metatarsal backbone and base osteotomy. All the 6 cases received revision surgery （debridement + bone grafting internal fixation）. Results After surgery， all wound had first stage healing. Follow-up for the patients lasted for 12～18 months， with the average time as 15 months. X-ray examination in the last follow-up showed complete heal in osteotomy end， without malformation or abnormal movement. Conclusion Main cause of postoperative nonunion after hallux valgus orthopedics is poor local bone quality， such as osteoporosis， in fection-induced failed internal fixation， and wide range of soft tissue dissection in surgery， which will influence blood flow for supplying metatarsal bones. Treatment measures are mainly based on first metatarsal shortening degree and complicated lesion in soft tissue.
【Key words】 Hallux valgus； Postoperative nonunion； Causes； Treatment
拇外翻矫形术后骨不连的发生率为1.6%～3.0%[1， 2]。由于拇外翻患者个性之间病理的差异性和手术方式的多样性， 即使对于有经验的足踝外科医生， 手术并发症也不可避免。现回顾2010年1月～2011年6月收治的6例拇外翻矫形术后骨不连患者的临床资料， 总结骨不连发生原因及治疗策略。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 本组6例患者中男1例， 女5例；年龄21～68岁， 平均年龄44.5岁；其中1例是第一跖骨远端截骨术（Mitchell）后骨不连， 因骨质疏松导致内固定失效所致， 病程6个月。2例原术式为Ludloff截骨， 因患者较早负重造成截骨面不稳定导致骨不连， 病程9个月。1例原术式为Scarf截骨， 病程11个月。患者有2型糖尿病史20年。1例原术式为Juvara截骨， 病程9个月， 因严重骨质疏松导致内固定失效所致。1例原术式为第一跖骨基底弧形截骨， 病程10个月， 因内固定不牢靠， 截骨端分离导致骨不连。
1. 2 方法 连硬麻醉下， 患者取仰卧位， 上止血带后手术。取第一跖骨内侧做一纵行切口， 切开皮肤全层， 分辨关节囊表面内侧皮神经， 将神经拉向背侧， 术中显露并松解骨不连部位后， 彻底清创， 清除瘢痕组织， 所有硬化和坏死组织， 通过锥板撑开器恢复跖骨长度， 恢复跖骨长度后， 立即用多根克氏针横穿第一、二和三跖骨， 临时固定第一跖骨， 再考虑如何最终固定， 根据骨不连的部位及跖骨缺损程度再行决定行结构性植骨或植入同种异体松质骨颗粒， 再联合应用空心钉和钢板进行固定。
1. 3 术后处理 术后1 d， 伤口更换辅料， 术后2～3 d患足拍X线片， 术后2周拆线， 穿前足减压勉负重鞋6周， 因为血管长入植骨块的速度较慢， 直到新生骨小梁通过时才允许负重（通常需6～8周）， 8周后再拍X线片， X线证实骨愈合后， 开始完全负重。
2 结果
术后切口均一期愈合， 患者均获随访， 随访时间12～18个月， 平均随访15个月， 末次随访时， X线片显示6例骨不连完全愈合。未出现畸形愈合及转移性跖骨痛， 钢板取出后跖趾关节有40～45°活动度。
3 讨论
临床认为跖骨截骨后6～8个月没有发生愈合为骨不连， 引起骨不连的确切原因尚不清楚， 但全身因素和局部因素均发挥作用， 全身性因素包括患者的代谢和营养状况， 一般健康状况和活动情况。最近有报道吸烟与骨不连有关[3]， 据报道：吸烟患者皮肤和皮下组织的血氧水平较低， 从而导致伤口愈合不良。另外， 大量的动物实验证明非甾体抗炎药降低了截骨端愈合率。Vora [4]分析了26例拇外翻矫形术后骨不连患者， 发现与以下几种局部因素有关：①截骨后内固定不牢靠， 固定时间不足；②术中软组织剥离范围大， 影响了供应跖骨的血运；③局部骨质量差， 如骨质疏松；④跖骨远端截骨后外移过多， 一般大于跖骨颈的1/2；⑤感染致内固定失效；⑥术后过早负重或粗暴的功能锻炼。
第一跖骨不论何种类型截骨引起的骨不连， 在骨不连的界面可能存在缺血的骨块， 清创后， 不愈合伴随跖骨短缩会更明显。清创能使骨端出血， 促进愈合， 但清创也能导致第一跖骨进一步短缩， 增加足外侧跖骨痛的发生率。治疗策略取决于是否合并跖骨痛， 第一跖骨现有的短缩程度， 是否存在跖趾关节的骨性关节炎以及合并的软组织病变（包括瘢痕、挛缩及神经炎）。在治疗骨不连时， 要确定是否需要恢复跖骨长度进行结构性植骨， 还是单纯进行松质骨颗粒植骨以促进愈合。骨干利于固定， 而干骺端利于愈合。术中在截骨不愈合端清创后， 用锥板撑开器恢复第一跖骨长度， 但同时要确保第一跖趾关节界面不要有太大压力， 因为这样会降低拇指的活动度。注意事项：①治疗骨不连时必须考虑患者的全身和局部因素处理， 治疗骨不连前患者应有良好的代谢和营养状况， 鼓励患者戒烟， 活动水平可根据不同需要而改变；②在制定治疗计划时必须考虑骨不连周围软组织的状况， 不能伸展的瘢痕组织， 常可导致皮肤坏死；③骨不连的治疗要求在恢复第一跖骨长度的前提下， 充分植骨和坚强固定；④植骨时骨的来源很多， 有自体骨、异体骨、人工合成骨替代物等。由于自体骨具有骨传导（基质）和骨诱导（蛋白质）的特性， 同时又含有骨原细胞， 是一种理想的植骨材料[5]， 自体骨松质通常取自髂骨；⑤治疗骨不连的内固定应提供足够稳定的固定， 但不要过于坚强；⑥建议骨不连患者在治疗过程中尽可能避免应用非甾体类抗炎药和激素；⑥值得注意的是骨不愈合的治疗目的不仅仅是促进愈合， 还要注意纠正跖骨的非正常位置避免畸形愈合。
参考文献
[1] Roukis TS， Meusnier T， Augoyard M. Nonunion rate of first metatarsalphalangeal joint arthrodesis with crossed titanium flexible intramedullary nails and a dorsal static staple with immediate weight bearing. J Foot Ankle Surg， 2012， 51（2）：191-194.
[2] Mankovecky MR， Prissel MA， Ts R. Incidence of nonunion of first metatarsal-phalangeal joint arthrodesis with autogenous iliac crest bone graft after failed Keller-Brandes arthroplasty： a systematic review. J Foot Ankle Surg， 2013， 52（1）：53-55.
[3] Adam SP， Choung SC， Yang G， et al. Outcomes after scarf osteotomy for treatment ofhallux valgus deformity. Clinical Orthopaedics & Related Research， 2011， 469（3）：854-859.
篇4
【中图分类号】R473.56 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2014）2-0004-01
在临床医学中心肌梗死非为几种类型，其中非ST段抬高心肌梗死，属非ST段抬高于急性冠状动脉综合症，该种心肌梗死的预后效果非常差，患有这类心肌梗死的患者属于高危患者，其死亡率以及再入院治疗率，远远高于ST段心肌梗死的死亡率和入院再治疗率。本文针对非ST段抬高心肌梗死预后的相关因素，以及有效治疗策略进行分析研究，具体结果如下：
1 资料和方法
1.1一般资料：随机选取在2010年4月至2011年4月，在我院进行非ST段抬高心肌梗死治疗的100例患者作为本次研究的对象，其中男性患者64例。女性患者36例，患者的平均年龄为65±13岁，均符合心肌梗死的标准。将6个月预后随访作为观察组，将2年预后随访作为对照组，对两组的临床资料进行回顾分析。
1.2治疗方法：所有患者采用阿司匹林、低分子肝素等药物进行治疗，所有患者没有药物禁忌，加用受体阻滞剂和血管扩张素转换酶抑制剂进行辅助治疗，PCI患者在手术前采用氯吡格雷。
对所有患者的入院治疗情况、病史、体格检查、各项辅助检查以及治疗措施进行详细的记录，并对患者的预后相关因素进行分析。
1.3随访记录：患者的心血管事件：主要终点事件、联合终点事件，将观察组的6个月预后作为近期预后，对照组的2年预后为远期预后。
1.4统计学处理：本次研究中的所有数据采用SPSS15.0统计学软件进行处理，计数资料，采用X2检验，计量资料采用t检验。患者的非ST段抬高心肌梗死预后影响因素，才有Cox生存模型进行分析研究，以HR值和95%CI作为相关标准，以P
2 结果
2.1患者的基本情况：参与6个月随访的患者有80例，其中男性51例，女性29例，平均年龄为68±10岁。使用阿司匹林的患者有69例，有35例患者采用早期保守治疗，45例患者是入院进行各项相关检查并根据病情进行针对性治疗。其中有40例患者是PCI。参与2年随访的患者有57例，男性34例，女性23例，平均年龄为70±11岁。阿司匹林使用者46例，有43例患者采用早期保守治疗，14例患者入院治疗，进行各项相关检查，根据病情进行相关的手术治疗。其中PCI患者有29例。
2.2随访中的心血管事件情况：6个月随访中有20例患者发生心血管事件，主要终点事件（心源性死亡）17例，联合终点事件（非致死性心肌梗死）3例。
3 讨论
心肌梗死是当前临床医学中常见的一种心血管疾病，该类型的疾病根据病因、病情将其非为不同的等级，心肌梗死这种疾病的死亡率非常高，而且预后效果差，其中非ST段抬高心肌梗死的死亡率非常高，在本次研究中观察组死亡率为25.0%，对照组死亡率为40.35%，死亡人数为20例和23例。
根据表三中的数据，可以知道影响非ST段抬高心肌梗死患者预后的主要因素为：年龄、心力衰竭、肾功能不全、阿司匹林、早期PCI。在分析影响非ST段抬高心肌梗死预后的主要危险因素之后，采取有效的治疗方法，制定治疗策略，有效的降低非ST段抬高心肌梗死的死亡率[1]。当前影响非ST段抬高心肌梗死患者预后的危险因素有很多，采用危险因素评估系统进行危险因素评估之后，再采用危险因素等级评估系统，对危险因素进行等级评估。
在本次研究中近期预后和远期预后的死亡率都非常的高，影响非ST段抬高心肌梗死患者预后的主要危险因素为表三中的几项，在这几项影响因素中，年龄是一项独立的非ST段抬高心肌梗死预后危险因素，而阿司匹林的使用是保护因素。在心血管事件中，心力衰竭的重要的危险因素，而且心力衰竭的预测值随着时间的增加而增加，在患者病程延长的过程中，患者肾功能不全的预测值也随呈现增加的趋势[2]。
对患者进行早期PCI策略和保守治疗策略相比，患者的心肌梗死死亡率有所下降。在众多非ST段抬高心肌梗死预后影响因素中，临床治疗主要针对改善患者的肾功能、心脏功能，虽然这种治疗策略还存在一定的不足，但是也取得了一定的成果。
综上所述进行早期治疗可以有效的改善非ST段抬高心肌梗死预后，影响非ST段抬高心肌梗死预后的主要因素为年龄、肾功能不全、心力衰竭、阿司匹林等。
篇5
关键词 锁骨骨折 感染 清创 灌洗
Analysis of the causes of infection after internal fixation of clavicular fractures and treatment strategy
Zheng Shuichang，Zhang Shaoan，Wei Xinjun，Cheng Feng
The Second Affiliated Hospital of Luohe Medical College，Henan 462300
Abstract Objective：To explore the causes of infection after clavicular fracture operation and prevention methods.Methods：52 cases with infection after clavicular fractures operation were selected from January 2003 to January 2013.They were treated respectively with steel plate，intramedullary nail，screw，needle，or wire fixation.We analyzed the cause of infection to find the control methods.Infection lesions after clavicular fractures operation underwent debridement，negative pressure or irrigation drainage，and the timely removal of internal fixation，when necessary，we gave the replacement of external fixation and flap to cover the wound treatment and other treatment.Results：With debridement，negative pressure or irrigation drainage，removal of internal fixation，the replacement of external fixation and flap to cover the wound treatment and other treatment，the infection were all controlled，and the average time was 23 days.Conclusion：After the clavicular fracture operation，infection is more.We should give active prevention and early detection，and timely treatment of debridement，negative pressure or irrigation drainage，removal of internal fixation，the replacement of external fixation and flap to cover the wound treatment and other treatment to control infection in time.
Key words Fracture of the clavicle；Infection；Debridement；Irrigation
锁骨骨折是一种很常见的骨折，发生率较高，约占全身骨折的6%。锁骨骨折的治疗观点目前尚未统一。绝大多数锁骨骨折的患者可通过非手术治疗痊愈，功能满意；但是，由于非手术治疗有较高的骨不连和畸形率的发生[1]，近年来一些学者提出积极的治疗观点，对于不稳定性锁骨骨折主张手术治疗。而锁骨骨折术后感染、骨不连等手术并发症在临床工作中也不少见，术后感染一般处理起来比较困难，预后不佳。
资料与方法
收治锁骨骨折术后患者52例，男30例，女22例，年龄14～65岁，平均37.5岁，骨折类型：开放性骨折38例，闭合性骨折13例，血友病合并骨折1例。骨折部位：锁骨远1/3骨折20例，中1/3骨折26例，近1/3骨折6例。致伤原因：车祸25例，坠跌伤12例，重物直接撞伤6例，碾挫伤5例，机器绞伤4例。细菌学检查结果：金黄色葡萄球菌30例，绿脓杆菌8例，表皮葡萄球菌4例，不动杆菌3例，大肠埃希菌1例，肺炎克雷伯菌1例，阴沟杆菌3例，无细菌生长2例。
治疗方法：采用臂丛麻醉，仰卧位，患侧肩胛下垫枕，沿以往的手术切口将病灶打开，使病灶内的脓腔充分暴露出来。脓腔暴露后，先取少量标本进行细菌学检查，然后对病灶进行彻底清创，务必使脓腔中的坏死组织和骨片彻底清除，以促进术后的愈合和康复。然后使用双氧水、0.9%氯化钠注射液对病灶进行反复的冲洗，以达到彻底消毒和清洗的目的，在这个过程中要注意不要损伤到重要的血管和神经，以免影响患者术后的功能恢复。在彻底清创后，如果在病灶部位有因为骨片缺如而不稳定的组织，则可以使用单边微型外固定器对其进行固定，但是在固定的过程中要注意避开感染的骨断端以及周边的重要的血管和神经。稀松缝合创缘，关闭伤口。在本研究中，有5例患者在对病灶进行充分扩创后，存在关闭困难，其中3例患者采用皮肤减张，然后可以将伤口顺利缝合，2例患者采用的是皮瓣转移术。对于所有的患者，在手术完成后，本就病情的不同，其病灶部位均使用不同的引流方式进行引流。在手术后，发现6例患者出现伤口不同程度的裂开，并且形成窦道，经过积极的处理后，伤口均闭合。拔管时应达到以下标准：在引流管内，没有脓液继续被引流出，或者对脓腔进行冲洗，其流出液清亮，对患者进行相关的辅助检查，其WBC、血沉、体温恢复正常，并且连续3次细菌学检查均为阴性，才可以拔出引流管。
结 果
在本研究中，所有患者的感染症状均得到了有效的控制，治疗效果较为理想。52例患者中，拔管时间10～35天，平均23天。除6例拔管后切口局部出现炎性反应经换药治愈，其余46例患者都达到了Ⅰ期愈合。手术后，对所有患者进行术后随访，时间3个月～8年。在随访的过程中，发现有8例患者出现骨折畸形愈合，6例患者出现骨不连，在给予患者手术矫正、植骨内固定等治疗后，达到了良好的治疗效果。
讨 论
骨折术后感染的主要原因：①开放性骨折清创不彻底或缺乏软组织覆盖，锁骨为“S”形弯曲长骨，内侧2/3三棱柱形并向前凸，外侧1/3扁平凸向后，全长皮下可触摸到。锁骨的这种解剖特点及骨科医师对开放性骨折软组织损伤程度及伤口污染程度估计不足，是导致术后伤口感染的重要原因之一。整个锁骨的上面仅有一层皮肤和极薄的皮下组织覆盖，皮肤血供较差，易受损伤，特别是直接暴力的损伤。开放的骨折端可直接显露于伤口外面，易发生污染，患者就诊时骨科医师对损伤程度及伤口污染程度认识不足，致使清创不彻底，术后发生伤口感染的机会增加。术中为彻底清创，有的医师盲目扩大清创范围，术后缺乏软组织覆盖而致感染骨外露。本组10例在二次清创时发现创口内遗留外界异物，造成感染。5例清创时发现皮肤或者皮下有坏死，手术切口无法直接缝合，减张或者皮瓣转移后伤口闭合。②骨折内固定方式选择不当。锁骨骨折手术适应证一般有以下几种情况：不能忍受外固定；闭合复位失败；合并血管神经损伤；开放性骨折；陈旧骨折不愈合；锁骨外端骨折；粉碎性骨折，骨折块向下有刺破血管危险等[2]。近年来，随着患者对治疗的要求越来越高和医疗器械和技术的发展，手术指征在逐步放宽。在治疗骨折时，尽量避免干扰骨折周围的软组织环境和骨折块的血运的操作[3]。因此，对于复杂骨折，周围软组织的处理与骨折本身的处理同样重要，治疗措施的选择要以保护软组织为前提[4]。骨外固定符合以上特点，是治疗开放性骨折较为理想的方法，其固定确切、操作简单、创伤小，对骨生长的生物学环境影响小，利于骨折愈合[5]。坚强牢固的骨折内固定忽略对骨组织血运的保护，增加了术后感染率[6]。本组有15例为解剖钢板内固定，术中术者自信清创彻底，创口清洁而采用了钢板内固定，由于对周围软组织的医源性破坏或者止血不彻底，导致骨折和内固定缺乏软组织覆盖，局部组织抗感染能力下降导致继发感染。③手术时机选择不当：本组5例，于开放伤后24小时～3天内行内固定手术治疗，由于污染伤口内已经存在细菌的繁殖，无法彻底清创，导致术后感染进一步加重；3例，局部组织肿胀出血明显，术中钝性分离造成的组织损伤失活，创口内出血又是细菌的良好培养基，利于病菌潜伏和繁殖，术后因组织肿胀，坏死组织无法及时引流，导致感染。④其他因素：本组3例，如未按无菌原则手术，受伤后就诊较晚，抗生素选择不当等。1例因创口内遗留手套破损片，致感染。
锁骨骨折术后感染的预防和治疗：感染的预防：①早期规范彻底清除开放伤口的异物及不健康的失活组织是原则，但不应为了彻底清创而盲目扩大清创范围；清创前后要配合利用广谱抗生素，必要时清创前即应取细菌培养。②选择正确的内固定方式：对清洁伤口，经规范的抗生素及清创后，可以一期行钢板或髓内针内固定，尽量减少对周围软组织的干扰；污染伤口，同样要强调正规严格的抗生素和彻底清创的实施，但是在内固定的选择上，一定要慎重，尽量简化内固定的形式。③闭合性骨折应待肿胀消退后，再考虑内固定治疗。④要严格遵守无菌操作规范，遵循内固定的基本原则，清点物品，严格把关，防止遗留。术中仔细操作，彻底止血，术后放置引流管或引流条，充分引流。骨折术后感染的治疗：①早期及时正规治疗：术后一旦发现有感染征象，并通过穿刺证实为深部感染，即应打开脓腔，进行彻底清创。术中要避免损伤重要的血管、神经，清创前后进行细菌学检查。本组52例清创后放置负压引流或病灶内持续灌洗引流，全身使用敏感抗生素。为改善患者全身体质，增强机体抵抗力，给予适量的维生素及高蛋白。②取出内固定，更换外固定：清创时由于有内固定材料的存在，不能有效清除伤口内坏死组织或污染物，从而使感染不易控制，创面难以闭合。因此，对于骨折内固定术后感染病例，清创时常规要拆除内固定物，对于拆除内固定的骨折，若有骨折的不稳定存在，应行外固定。③皮瓣覆盖创面：感染创面因创口周围炎性增生，血供下降，抗感染能力下降；而皮瓣一般血供丰富、抗感染能力强，能有效地控制感染，修复创面[7]。如创面较小，感染局限，可以考虑局部皮瓣转移覆盖创面；如创面较大，用一般的局部转移皮瓣不能达到修复目的，我们可以考虑附近带蒂转移皮瓣修复。感染控制后若肢体存在骨折畸形愈合、不愈合以及关节功能障碍，则后期行手术矫正、植骨及康复治疗。
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关键词： 颅内肿瘤；胶质瘤；基因治疗；靶向治疗；综述文献
1 胶质瘤基因治疗的分子策略
当前胶质瘤基因治疗的分子策略包括以下几点：细胞周期调节基因及凋亡基因；自杀基因；免疫调节基因；抑癌基因；血管生成抑制基因；PKR途径。以上各策略可相互联系,并相互联合。
1.1 细胞周期调节基因及凋亡基因
P53与E2F1作为2种非常重要的抑癌基因, 维持基因组的稳定, 激活细胞凋亡。两者所不同的是P53基因可调节细胞周期，其变异能明显降低恶性脑胶质瘤对化疗的敏感性, P53基因在脑胶质瘤的高突变率为脑胶质瘤的靶向性基因治疗提供了重要的基础［2］。与P53基因不同的是，E2F1是直接调控细胞周期［3］，其不良反应是它对正常细胞的毒性和潜在的致瘤性。
1.2 自杀基因
自杀基因治疗在胶质瘤的基因治疗中占有极为重要的地位。自杀基因(suicide gene)疗法是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶类能将细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成细胞毒性产物，以达到杀死肿瘤细胞为目的。不少学者［4］通过研究发现， 只要少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定比例混合后共同培养，不仅转染的癌细胞被杀灭，二者相互接触后相邻的未转染的癌细胞也大量死亡，即“旁观者效应”。该效应可使仅部分肿瘤细胞转染了自杀基因的整个肿瘤均受到经自杀基因转化了的抗癌“药”的攻击而全部消退。至于旁观者效应发生的机理, 多数研究表明它与细胞间的缝隙连接和免疫效应细胞在肿瘤病灶中的浸润有关。（1）细胞毒性产物通过细胞间的缝隙连接进入邻近细胞。（2）被破坏的细胞释放毒性物质和凋亡小体进入周围微环境, 并被邻近细胞摄取。（3）自杀基因杀死的细胞释放细胞因子, 进一步吸引免疫细胞进入肿瘤, 介导抗肿瘤免疫反应。（4）导致血管内皮细胞死亡, 引起肿瘤细胞缺血坏死。在肿瘤细胞中旁观者效应的物质基础一缝隙连接数量较正常细胞缺乏, 利用环腺昔酸（cAMP）可以诱导缝隙连接形成或导入缝隙连接的亚单位连接素43（connexin 43）的cDNA, 从而大大加强旁观者效应［5］。临床上，意大利的Colombo等［5］用结合的IL2／HSV．tk基因疗法治疗再生的多形恶性胶质细胞瘤，他们向瘤内注射转录病毒载体引导细胞(PVPC)，然后静脉注射GCV，结果显示，实验组的患者的存活率提高。
1.3 免疫调节基因
免疫调节基因主要是通过基因重组技术来增强机体的抗肿瘤免疫功能达到治疗肿瘤的目的，这主要包括3个方面：（1）肿瘤抗原提呈功能的加强，如从临床患者的血液和手术切除标本中获取自身抗原提呈细胞，在体外经GMCSF等细胞因子作用下扩增，体外表达肿瘤抗原的DNA或mRNA，然后回输入患者体内；（2）细胞因子基因转导肿瘤细胞；如将一基因体外转导脑胶质瘤细胞, 体外培养扩增后接种于病人自身皮下, 可发现肿瘤病灶明显缩小, 颅内胶质瘤明显坏死。（3）B7共刺激分子基因导入肿瘤细胞［7］。Mukhecjee等［8］在靶向T11结构的一种蛋白质(aprotein known as T11 target structure，T11 )注射N乙基·N·亚硝基脲（ ENU)诱导的免疫抑制大鼠后，观察外周和神经系统的改变以及脾，脑浸润淋巴细胞的细胞毒性活性变化，用流式细胞仪测定肿瘤细胞和小神经胶质细胞含量，发现T11TS不仅增加了凋亡细胞的数目，同时降低了分裂细胞数目，而脾和脑浸润细胞的细胞毒性也有显著增加。数据证实了TILTS对实验脑肿瘤的特殊细胞凋亡作用。
1.4 抑癌基因治疗
抑癌基因亦称为抗癌基因，是指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前已分离克隆出20余种抑癌基因，而D53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，不少研究也证明肿瘤的生成会伴随p53的缺失。Michiue等［8］使用了基因突变的p53蛋白，将羧基末端的多赖氨酸残基用精氨酸取代的产物，转导人胶质瘤细胞，由于存在对Mdm2(鼠双微基因)介导的遍蛋白化耐受性，这种蛋白具有较强的转导调节活性，同时抑制胶质瘤细胞的增殖，表现了其在P53基因治疗方面的应用潜力。
1.5 血管生成抑制基因
固体肿瘤的生长及增殖，需要新生血管提供足够的血运。而胶质瘤自身能产生一些血管生长因子，促进血管内皮细胞的分裂增殖。因此抑制肿瘤血管形成成为冶疗肿瘤的另一策略。早在1971年Fdkamn首先发现肿瘤血管生成因子，并由此提出了对肿瘤血管调控因子及其作用环节进行干预，经抗血管生成途径治疗肿瘤的新方法。它的优势是：（1）抗肿瘤血管生成治疗不是直接攻击肿瘤细胞, 不会产生放疗和化疗所造成的肿瘤细胞遗传性状的不稳定和治疗后耐药性。（2）由于肿瘤部位的血管内皮细胞比肿瘤细胞遗传性状稳定, 而正常血管内皮细胞处于不分裂的状态, 故抗肿瘤血管生成治疗对其影响不大。（3）另外由于内皮细胞本身就浸泡在血液中, 药物到达血管比到达肿瘤要容易得多。这说明抗肿瘤血管生成治疗与传统治疗相比有内在的优势, 已成为一种重要辅助治疗方式。胶质瘤作为一种实体瘤, 抗肿瘤血管生成治疗也具有重要价值。
1.6 PKR途径
活化性双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)是一种生长抑制性蛋白, 通常它能使病毒感染的细胞活化, 并诱导其死亡［10］。
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ALI/ARDS的发生发展是环境因素和遗传因素综合作用的结果，发病机制复杂。常见导致ALI/ARDS发生的危险因素包括肺内源性因素如肺炎、误吸等，和肺外源性因素如全身性感染、创伤、烧伤、休克等［2］。然而，在接触危险因素的人群中，仅有部分患者发展成为ALI/ARDS，并最终死于ARDS，而且即便是同一危险因素对人体的打击程度相同，不同个体对ALI/ARDS的易感性及预后也不同，推测基因在人类对ALI/ARDS的易感性及预后中扮演了重要的角色［3］。目前发现与ALI/ARDS发生发展相关的基因位点约有17个，它们参与机体免疫炎症反应、氧化应激、凝血、血管功能损伤等过程，并最终影响ALI/ARDS的发生、严重程度及患者的预后［4］。
1.1 基因影响ALI/ARDS的易感性
目前发现有多个基因位点的基因多态性与ALI/ARDS易感性相关，主要包括血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因多态性、表面活性蛋白B（surfactant protein-B，SP-B）基因多态性等。ACE基因位于人类第17对染色体长臂3区5带（17q35），其基因型包括3种：插入型纯合子I/I、删除型纯合子D/D和杂合子I/D。D/D基因型患者的ACE表达高于I/I基因型患者，在ARDS患者中D等位基因出现的频率远高于对照人群［5-6］。SP-B是防止肺泡塌陷，维持正常肺功能的重要物质［7］。SP-B是由2号染色体短臂上的单基因编码，其基因组序列具有特征性，不同人群第4个内含子内CA单核苷酸串联重复序列数不同， ALI/ARDS患者重复序列出现的频率比健康对照组高［8］。此外白细胞介素（interleukin，IL）IL-6、IL-10基因多态性也与ALI/ARDS的发生相关［9-10］。提示存在这些基因位点多态性的患者更容易发生ALI/ARDS。
1.2 基因影响ALI/ARDS的严重程度
研究发现IL-8、IL-10及核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）基因多态性与ALI/ARDS的严重程度相关。IL-8基因多态性位点251位A等位基因合成IL-8比T等位基因明显增加，患者病情重，机械通气时间延长［11］。而IL-10基因型为1082GG的患者病情严重程度降低，器官功能障碍的程度亦降低［12］。NF-κB是重要的导致炎症反应的核转录因子，其多态性基因位点的插入缺失突变影响ALI/ARDS患者的严重程度，而与患者预后无关［13］。
1.3 基因影响ALI/ARDS患者的预后
目前与ALI/ARDS患者预后相关的基因包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和ACE2。SOD是一种抗氧化酶，SOD基因位于4号染色体上，其基因多态性来源于编码区编码精氨酸的序列被替换为甘氨酸序列，则细胞内SOD的产生将增加10倍，抗氧化作用加强，患者预后改善［14］。ACE D/D基因型患者不仅与ALI/ARDS易感性相关，也影响患者的预后，含有此类基因型的ALI/ARDS患者预后差［6］。
可见，ALI/ARDS的发生发展与基因异常表达密切相关，提示ALI/ARDS的治疗不应该仅停留在器官功能支持层面上，基因治疗可能是其重要的治疗策略之一。
2 ALI/ARDS基因治疗策略
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因或核苷酸序列通过一定方式导入靶细胞或组织以纠正基因的缺陷或者改变某一特定产物的表达，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。可分为胚胎细胞基因治疗和成体细胞基因治疗［15］。
2.1 ALI/ARDS基因治疗的优势
ALI/ARDS采用基因治疗具有一定的优势［16］：（1）ALI/ARDS是一个急性发作并且病程相对短暂的综合征，仅需短疗程基因治疗，无需反复给药诱发机体的免疫炎症反应；（2）气道上皮和远端肺泡上皮可以通过气道内给药，靶向作用好；（3）心脏泵出的血液需通过肺循环才能到达全身各处器官，因此通过静脉给药对肺微血管内皮细胞也具有较好的靶向作用；（4）基因治疗可针对ALI/ARDS的不同时期发挥治疗作用；（5）基因治疗可特异性地针对ALI/ARDS损伤和修复的某一机制如凝血、氧化应激、上皮间充质转化等发挥靶向治疗作用。
2.2 ALI/ARDS基因治疗的分类
ALI/ARDS基因治疗按基因操作方式分为两类：一类为基因修正和基因置换，即在原位将缺陷基因的异常序列进行精确的修复。通过同源重组技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强和基因失活，即不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达［17-18］。此外，通过药物等方式调节细胞或组织器官的外遗传机制如DNA的甲基化、非编码RNA、及组蛋白翻译后修饰（甲基化、乙酰化、磷酸化）亦可达到增高或降低某一特定基因表达的目的［19］。尽管ALI/ARDS的发生可能与患者存在某种易感基因相关，但目前ALI/ARDS的基因治疗主要依赖第二类方法来改变肺组织局部相关产物的表达，从而促进肺损伤的修复。
2.3 ALI/ARDS基因治疗的载体选择
理想的载体不仅能够高效地向靶细胞转染较大外源性基因片段，防止其被核酶降解，还需调节外源基因在细胞内的表达，并且不产生插入突变，不引起免疫炎症反应等不良反应。目前常用载体分为病毒载体和非病毒载体两大类［18］。
2.3.1 病毒载体
腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等是目前常用的病毒载体。腺病毒具有嗜上皮性，在ALI 的治疗过程中可能会导致一过性的肺泡上皮损伤，诱发免疫炎症反应［20］。逆转录病毒仅能转染分裂期细胞，对静止期细胞转染效率低，其应用受到一定限制［17］。腺相关病毒是一种有DNA 缺陷的非致病性细小病毒，具有安全性好、宿主范围广等优点，目前已成为基因治疗研究的热点［21］。
2.3.2 非病毒载体
质粒、脂质体、寡聚核苷酸等非病毒载体在ALI/ARDS中也有较多的应用。它们成本低、安全，但其转染效率较病毒载体低［16］。近年来ALI的细胞治疗尤其是干细胞治疗发展迅速，目前已进入临床实验阶段，以细胞为基因载体的治疗形式亦得到较好的发展，不仅转染效率高，而且减轻免疫炎症反应，与细胞治疗具有协同作用，因而具有广泛的前景［22］。
3 基因治疗在ALI/ARDS治疗中的应用
ALI/ARDS的基因治疗主要通过携带肺保护基因至损伤肺组织，在局部高表达或沉默相关基因，抑制肺部炎症反应，促进肺水清除，改善内皮细胞功能，减轻肺纤维化，阻断ALI/ARDS发生发展的病理生理进程，促进肺损伤修复而达到治疗的目的。
3.1 基因治疗促进肺水肿液清除
通过基因转染促进肺水肿液的清除，从而纠正低氧是ALI/ARDS的重要治疗措施。肺水肿的发生不仅与肺毛细血管内皮-肺泡上皮屏障的破坏相关，还与肺泡上皮细胞肺水清除功能下降有关［23］。研究表明，在肺泡上皮细胞上存在多种离子通道，包括Na+通道（ENaC）、Na+-K+-ATP酶、K+通道等，随着Na+的转运可促进水的清除。不仅如此，角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）也可促进肺水的清除［24］。研究发现通过各种基因转染方法可使ENaC、Na+-K+-ATP酶及KGF等基因高表达，从而增强肺水转运而减轻肺水肿。
病毒载体介导的基因转染可显著促进肺水肿的吸收。目前已证实，在正常大鼠及呼吸机相关的ALI大鼠及高氧诱导的ALI大鼠的治疗中发现，由重组腺病毒介导的基因转染Na+-K+-ATP酶的α2亚基和β1亚基，可明显促进肺水清除［25-26］。Qiao等［23］通过慢病毒向分离的原代肺泡上皮细胞转染Na+-K+-ATP酶的β1亚基，亦可以增加Na+-K+-ATP酶的活性，促进肺水清除。
非病毒载体亦可承载促进肺水清除相关的基因。Stern等［27］的研究发现由脂质体介导的Na+-K+-ATP酶的α亚基和β亚基基因转染可减轻硫脲诱导的小鼠肺水肿的程度，而输注脂质体导致的肺部炎症反应轻微。脂质体还可转载KGF基因减轻油酸诱导ALI小鼠的肺损伤［28］，但较腺病毒转染效率低，效果差［29］。此外，电穿孔法可以直接把裸露的DNA转入小鼠肺组织，不仅可以减轻内毒素诱导小鼠肺水肿，还可减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，减轻肺组织的损伤程度［30］。可见，非病毒载体系统可介导基因转染促进肺水清除。
3.2 基因治疗抑制肺部炎症反应
失控的炎症反应是ALI/ARDS发生发展的重要机制之一，调节肺部及全身的炎症反应是ALI/ARDS基因治疗的重要方向。
基因治疗调节ALI/ARDS过度的炎症反应主要是通过携带具有抗炎作用的细胞因子的基因至肺损伤组织局部高表达，从而发挥抗炎的作用。尽管病毒载体可诱导宿主发生免疫炎症反应，但应用腺病毒向ALI小鼠转染IL-10［31］、干扰素蛋白10（IP-10）［32］、IL-12［33］、转化生长因子β1（TGF-β1）［34］等细胞因子基因后，被证实具有较好的抗炎效果，免疫炎症明显减轻，肺损伤也有所修复，并且小鼠病死率也有所下降。
为克服病毒载体诱发并加重宿主的免疫炎症反应，以非病毒载体为转染介质也有长足的发展，传统的以脂质体为载体的基因转染尽管可以一定程度上减轻肺损伤，但由于其转染效率低，抗炎效果不佳。近年来以细胞为载体的基因转染在ALI的治疗中具有重要的作用， McCarter等［35］以及Xu等［36］的研究证实通过向成纤维细胞和间充质干细胞内转染血管生成素1基因，并移植入内毒素诱导的ALI小鼠体内，可明显减轻小鼠肺部的炎症反应及肺损伤程度，而由细胞本身诱导的小鼠肺炎症反应非常轻微。因此，以细胞为载体的基因治疗是ALI/ARDS的治疗未来的发展方向。
3.3 基因治疗改善肺微血管内皮功能
内皮功能受损是ALI/ARDS的重要特点之一，在ALI/ARDS发生过程中具有重要的作用。内皮功能受损主要表现为其分泌功能和屏障功能受损，导致肺部炎症反应和肺水肿发生。因此，调节内皮功能是ALI/ARDS的重要治疗靶点之一。
基因治疗对内皮功能也具有一定的调节作用。它主要是通过转染内皮相关基因至机体内，使其在局部高表达，从而达到治疗的目的。Chicoine 等［37］的研究发现，将载有诱导性一氧化氮合酶（induced nitric-oxide synthase，iNOS）的腺病毒通过气管内注射移植入大鼠肺内，大鼠肺动脉内皮收缩功能减弱，并呈现时间依赖性，大鼠肺动脉高压明显改善。McCarter等［35］把血管生成素-1基因转染入成纤维细胞使其高表达并移植入LPS诱导的ALI大鼠体内，大鼠肺血管内皮分泌iNOS、血红素氧化酶增加，而内皮素-1表达降低，细胞间细胞黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1的表达恢复正常，肺内皮通透性降低，炎症反应减弱，肺损伤减轻。因此，基因治疗可以调节肺血管内皮细胞功能，促进肺损伤修复。
3.4 基因治疗减轻肺纤维化
肺纤维化是ALI/ARDS发生发展的终末阶段，病程难以逆转，致死率高。目前主要的治疗是激素抗炎治疗，但疗效不佳，缺乏有效的治疗方法。近年来基因治疗为其提供了新的途径。研究发现，在博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型中，通过转染TGF-β1的RNA干扰片段，使小鼠TGF-β1基因沉默后小鼠肺纤维化程度明显减轻，肺功能增强［38］。在放射性肺损伤小鼠模型中，通过肌内注射载有可溶性肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）受体1的质粒后发现TNF-α的活性降低，肺纤维化减轻，免疫炎症反应轻微。不仅如此，以细胞为载体的基因治疗在肺纤维化中也得到了应用［39］。Aguilar等［40］在体外通过基因工程技术将KGF基因转染至间充质干细胞，并移植入博来霉素诱导的ALI小鼠体内，小鼠肺组织损伤减轻，后期肺组织内胶原沉积明显减少。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸的应用，亦可通过外遗传机制调控基因表达，发挥抗纤维化作用［41］。可见，基因治疗可以明显减轻肺纤维化。
4 ALI/ARDS基因治疗面临的挑战
尽管ALI/ARDS基因治疗已取得一定进展，但仍然还面临着许多挑战［16］。 （1）合适的治疗基因靶点的选择 ：目前影响ALI/ARDS的发生发展的因素很多，但选择合适的基因治疗靶点仍不确定；（2）载体的选择与改进：载体是介导基因治疗的重要工具，但在发挥治疗作用的同时也会对机体产生一定的不良反应，如诱导免疫炎症反应和宿主基因的插入突变和失活，因此对载体进行改进有利于提高基因治疗的安全性，也是基因治疗的前提所在；（3）目的基因的表达调控：对导入宿主细胞的目的基因的表达进行调控，有利于调控基因在不同的疾病状态下充分发挥治疗作用，是未来的研究方向；（4）基因治疗的靶向性：尽管ALI/ARDS的基因治疗具有一定的靶向性，但如何使目的基因在宿主基因某一特定部位进行插入整合仍是目前研究的难题。
总之，基因治疗在 ALI/ARDS治疗中的地位越来越受到重视，基因治疗可以通过抑制过度的炎症反应，促进肺水清除，改善内皮功能，减轻肺纤维化，从而减轻ALI /ARDS的严重程度并改善预后，但在治疗的靶向性、安全性等问题上仍然面临许多挑战，是今后重点的研究方向之一。
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1反义基因治疗
肝癌的发生、发展过程中许多癌基因及生长因子的基因产物大量表达，应用反义核酸在转录水平和翻译水平阻断某些基因的异常表达，以期阻断癌细胞内的异常信号传导，使癌细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。反义基因包括反义RNA、反义DNA和核酶3类。根据碱基互补的原理，利用与目标基因特定序列互补的短链核苷酸片段来封闭目标基因表达，或利用核酶与相应的mRNA结合使其降解，均可达到基因治疗的目的。Wang等［1］利用AFP反义寡核苷酸治疗体外和裸鼠的SMMC7721肝癌模型取得了明显的抗癌作用，减少了AFP的表达，抑制SMMC7721细胞的增生。有研究显示［2］，引用反义胰岛素养生长因子(Insulingrowth factor I，IGFI) 寡核苷酸转染人肝癌细胞，发现肝癌细胞的凋亡阳性指数明显增加，并且被转染的癌细胞的CEA和AFP的分泌下降，表明反义IGFI寡核苷酸可以抑制肝癌细胞的增殖、促进分化并诱导肿瘤细胞的凋亡。
2自杀基因治疗
某些病毒、细菌等原核生物含有一类基因，其编码的酶能将原来无毒的药物前体转化为具有细胞毒性的代谢物而杀伤宿主细胞，这类基因称为“自杀基因”。这种特有的转换酶基因-自杀基因导入体内后，利用其产生的酶将无毒或低毒的药物前体转成细胞毒性代谢产物，从而杀死肿瘤细胞。近年来有关此类研究显示出良好的应用前景。目前常用针对肝癌基因治疗的有单纯病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊环鸟苷系(HSVTK/GCV) 和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系统。有研究表明［3］，将“自杀基因”单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinease，HSVTK)转染肿瘤组织，则该细胞的HSVTK将前体药Gancyclovir(GCV)转化为对分裂细胞有杀伤作用的代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞，对肝细胞肝癌在体外有一定的疗效。Won等［4］通过单纯疱疹病毒将AFP反转剪接靶RNA构成酶导入肝癌细胞，取代HCC高效表达AFP的RNA残基，结果明显延缓肿瘤细胞生长并降低了细胞中表达AFP的RNA水平。
3免疫基因治疗
免疫基因治疗通过基因重组技术增强机体的抗肿瘤免疫功能而达到治疗肿瘤的目的。目前有基因疫苗免疫治疗、免疫刺激性因子免疫治疗、共刺激分子免疫治疗、活化的淋巴细胞进行过继免疫治疗、DC为基础的免疫治疗。基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。DC是体内最强专职抗原递呈细胞，能有效刺激静息的细胞，诱发初次免疫应答，还具有发动和调节抗肿瘤免疫反应的特性。薛刚等［5］应用IFNγ修饰的DC刺激T淋巴细胞，发现IFNγDC可促进T细胞增殖，并诱导T细胞向Th1分化。IFNγ的修饰可明显增强肝癌细胞抗原负载的DC所活化的T细胞对肝癌细胞的杀伤作用。由于IFNγ的修饰能促进DC成熟，增强DC促进T淋巴细胞增殖的作用，诱导细胞免疫，增强T细胞的细胞毒作用，使T细胞能有效地杀伤肿瘤细胞，将VEGFR和Tie 基因共同转染DC，不仅活化了特异性CTL，还可以阻止肿瘤新生血管生成，从而将肿瘤免疫治疗和抗肿瘤新生血管生成治疗有效结合起来［6］。
4抑癌基因治疗
到目前为止发现的抑癌基因有p53，转甲状腺基因及其他抗癌基因和Nras，Cmyc，Cest2，IGFⅡR以及CSF1等，在所有的抑癌基因中p53基因的突变率较高，它的失活会阻止细胞进入凋亡，从而使之处于持续分裂状态而增加突变及转化的概率。通过恢复或添加肿瘤细胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢复抑癌基因的功能，从而抑制肿瘤的生长和转移，常用野生型p53、p16 等。p53基因的突变或者失活不仅使细胞本身周期失调具有致瘤性，并且可以影响细胞对其他凋亡信号如TGF的感受性下降。穆红等［7］使用p53cDNA的真核表达质粒p53pcDNA3对人源性肝癌细胞系HepG2进行转染，采用RNA原位杂交的方法证明了外源p53cDNA在HepG2p53细胞中的转染和转录，成功导入的p53cDNA可诱导HepG2细胞发生凋亡。p16基因也为抑癌基因，原发性肝癌中p16基因也常表现失活，p16基因能阻抑细胞生长于G1S期，但不诱发凋亡。p16启动子甲基化后，肝癌发生概率明显提高，尤其对于HBV感染者。
5抗血管生成基因治疗
肿瘤血管生成是肿瘤生长转移的关键步骤，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的结果。肿瘤血管生成是由肿瘤细胞和肿瘤浸润炎症细胞，如巨噬细胞或肥大细胞产生的促血管形成因子所介导的。恶性肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成，为了不断地获得氧和养料，肿瘤细胞就要不断的分泌促血管形成因子，不少细胞因子与肿瘤血管形成密切相关，因此，抑制肿瘤血管形成可以导致肝癌细胞衰退。肿瘤血管生成中最主要的是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。有试验表明，用脂质体法转然反义RNA对抗血管内皮生长因子，能够抑制裸鼠的种植性肝癌的生长［8］。
6RNA干扰技术的应用
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，也称为基因沉寂疗法，是利用双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制，从抑制特异的基因表达的方法。利用 RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达，从而有效抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。体外RNA干扰技术的主要特点在于其能利用细胞本身的成分，使外源重组干扰片断能持续转录，同时能以一种类似酶促方式对目标mRNA进行切割，从而形成高效、稳定而持久的干扰效应。尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)是一种在肝癌细胞中高表达的蛋白，参与机体的多种生理和病理过程，其表达水平与患者的生存呈负相关。李华等［9］构建针对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因siRNA真核表达载体pLXSNEGFPU6siTERT，以hTERT siRNA逆转录病毒为表达载体，感染HepG2细胞24、48、72 h后，端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%( P＜0.05)，感染后24h细胞凋亡29.05%，肝癌细胞生长受到抑制，并存在一定量效和时效关系。除了上述介绍的六种比较经典的基因治疗方法外，近年又出现了一些新的基因治疗方法。有专家设想利用超声/微气泡介导目的基因进入靶组织的靶胞内［1011］，可以达到靶向性、可控性转导基因治疗的目的，有望成为有实用价值的临床基因治疗技术。不同的基因治疗策略联合应用可相互协同，常采用免疫基因和自杀基因的联合治疗［12］，在增强机体抗肿瘤免疫能力同时直接杀伤肿瘤细胞，达到根治肿瘤的目的。
7展望
目前肝癌的基因治疗策略已有很大发展，具有广阔的应用前景，而早期临床证据和临床实验表明，基因作为一种药物有重要的地位，将来的发展方向主要集中在下列几方面：①寻找转染效率高、基因容量高、毒性小的基因治疗载体。近年来，利用超声对比剂微泡作为基因载体并用超声技术处理，提高转染率已取得成功［1315］；②开发基因，实现可调控的基因转染系统，以期提高在肝癌组织中的表达阳性率，进行更加精确的基因治疗；③设计更具靶向性和安全性的基因转运系统，寻找肝癌特异转录调控元件，从而使外源基因能够持续、稳定和特异表达，真正实现肝癌的基因治疗从动物实验转向临床应用，将是肝癌基因治疗的主要研究方向。尽管还存在很多需要解决的问题，但随着分子生物学及相关学科的发展，我们相信肝癌的基因治疗终将会广泛地应用于临床。
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篇9
癌症是危害人类健康的第一大杀手。虽然目前医疗技术不断进步，科技含量的比重越来越大，抗癌的手段越来越多，但还是不能完全消除癌症的威胁，很多癌症患者因保守癌症的摧残和折磨而痛不欲生。随着基因工程的不断崛起，用以病毒为载体的基因治疗方法来对付癌症，已成为国内外医学癌症专家的研究方向。
1 癌瘤的形成机理
癌细胞繁殖多了，便会结成癌瘤。癌细胞海辉扩散开来，在身体的各处生产癌瘤。它们行为放肆，无时无刻不在消耗身体的能量和营养物质，毫无忌惮地浪费身体的资源。打个比方来讲，一个葡萄糖分子，有正常细胞来利用，可以产生38个ATP，而如果由癌细胞来用，只产生2个ATP，然后便将其余的能量分子全部当做垃圾丢掉了。大部分的癌症病人，到了晚期，身体的营养都被癌细胞消耗掉了，因此看起来骨瘦如柴，毫无生气。
2 病毒杀掉癌细胞的原理
所谓以病毒为载体的基因治疗，也就是我们来合成病毒，让其钻进癌细胞，并在癌细胞内部生活和繁殖，毫不留情地消耗掉癌细胞的生存资源，使得癌细胞“死掉”，从而起到治疗癌症的作用。简单来说，就是“以其癌之道反之其癌之身”。
3 癌症基因治疗中常用的病毒载体
癌症的基因治疗是根据不同癌症的发病机制，通过合适的载体将肿瘤抑制 基因、炎症因子基因或小RNA等治疗基因导入到肿瘤细胞中。理想的载体是安全性高、能有效将足量治疗基因针对性地导入靶细胞中(包括目标组织内的靶细 胞)，并能在其中持续特定时间表达治疗剂量的分子。
目前，癌症基因治疗相关的载体系统仍处于研发阶段，常用载体主要有两类：病毒载体和非病毒载体。非病毒载体主要包括直接注射或借助物理化学手段，如电转化、超声波、脂质体等，将的DNA或RNA直接导入病灶细胞中，缺点是转入效率低，且在体内不能长久表达。病毒是一类由核酸(DNA或RNA)和蛋白质组成的寄生于活细胞中的微生物，由于其高感染性，经改装后病毒载体可将外 源基因高效转入宿主细胞。病毒载体依据其在宿主细胞中增殖与否，分为复制型与非复制型病毒载体。出于安全考虑，非复制型病毒载体在近20年一直广泛应 用于疫苗及基因治疗研究，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒。是目前 最常用于基因治疗的病毒载体.
近几年，癌症基因治疗载体已开始逐渐由非复制型病毒载体向复制型载体 过渡。复制型载体的特点是病毒能够选择性地在目标癌细胞中复制增殖，介导细胞裂解，释放出的病毒继而感染肿瘤实体中的邻近细胞，从而形成一个在瘤体组织中不断感染—增殖—裂解癌细胞的循环。非复制型病毒载体的一个明显缺陷是无法感染肿瘤实体内部大部分细胞，因此不能最大限度地控制癌细胞的增殖及 转移，而复制型病毒载体则可克服这种缺陷。复制型肿瘤裂解载体的效果目前已在临床前试验中得到广泛验证，且已进入临床试验阶段。
4 结论与展望
癌症是由多种因素导致的疾病，发病机制复杂，单一疗法很难治愈，未来的 肿瘤治疗必定是多种策略联合使用，包括更灵敏的诊断试剂、癌症疫苗，以及继 传统疗法之后新兴的基因疗法、免疫疗法等多种生物疗法。作为治疗癌症非常有潜力的一种策 略，基因治疗通过最大限度地加强病毒载体对肿瘤细胞的特异性，以及尽可能地减少对正常细胞的副作用。而将为癌症患者提供比传统疗法更有效 的治疗效果和安全性。
小分子和蛋白类药物的诸多缺点，限制了其在实际治疗中的应用。而将溶瘤腺病毒应用于靶向肿瘤干细胞的癌症治疗非常适合。但在实际应用中，仍有一些需要解决的问题。首先是如何进一步提高腺病毒对肿瘤干细胞的靶向性。我们可以通过改造病毒外壳蛋白来达到此目的。外壳纤维蛋白(fiber)头部的HI环决定腺病毒靶向细胞的类别，其内部序列的变化会影响fiber与靶细胞表面受体的相互识别，从而改变病毒的靶向性。Reynolds等[1]将RGD三肽插入HI环区内，改造后5的型腺病毒可以转染不表达柯萨奇—腺病毒受体(coxsackie—adenovirusreceptor,CAR)的细胞，改变了其原先的靶向性。若对fiber的HI环的氨基酸残基序列进行改造，使之拥有与肿瘤干细胞表面特异受体的强结合力，可以使腺病毒获得对肿瘤干细胞的靶向性，提高感染率。
参考文献
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[中图分类号] R749.1+6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）31-15-02
The Application of Adeno-associated Virus Load in Alzheimer’s Disease
GAO Huifang
Dehui People’s Hospital in Jilin Province, Dehui 130300, China
[Abstract] To explore the application of adeno-associated virus load in Alzheimer’s disease. Adeno-associated virus load is the one which is often used in gene therapy, because it owns the unique biological characteristics of integration on special spot, causing no other side effects. According to the results of a series of experiments and study, it can express itself forever and has little bad immune reaction. Its pre-clinic experimental result is ideal. Its advance of reorganization brings hope to future gene therapy and it lays a solid foundation for future clinic treatment.
[Key words] Adeno-associated virus; Alzheimer’s disease; Open reading frame; Nerve growth factor
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体是目前基因治疗中最常用的病毒载体。由于其具有定点整合、无致病性、可长期表达、免疫反应性小等独特的生物学特性，日益受到人们的重视。现针对腺相关病毒的生物学特性和其在阿尔茨海默病中的应用作一综述。
1 AAV的生物学特性
AAV属于微小病毒科、依赖病毒属，直径约25nm，无包膜，呈二十面体对称结构。当有辅助病毒如腺病毒等存在时，AAV才能够进行复制和装配，因而得名腺相关病毒。目前AAV已经有12种人源性血清型（AAV1～AAV12）和110多种非人灵长类动物源性血清型[1]被发现，其中，AAV2是目前研究最为透彻、应用最为广泛的血清型。
AAV2基因组[2]是长4.7kb的线性单链DNA，包含两个开放阅读框（open reading frames，ORFs）。左侧ORF编码复制调节基因rep，可产生4种Rep蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68是P5启动子的转录产物，分别通过非拼接和拼接的形式产生，是AAV各生命周期中重要的反式作用因子。在辅助病毒存在时，它们可以促进AAV基因的表达，反之则产生抑制作用，为AAV的复制所必需。由P19启动子转录、分别通过非拼接和拼接形式分别得到Rep52和Rep40蛋白，能够促进单链病毒DNA自聚，以利于其顺利为外壳蛋白所包被。右侧ORF编码cap基因，通过P40启动子转录产物的不同拼接形式，产生3种不同的病毒衣壳蛋白―VP1、VP2和VP3。在AAV2中，三种蛋白以1110的比例构成病毒衣壳。
ORFs两侧为长145bp的反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）。ITRs是AAV的顺式作用元件，其外侧的125个核苷酸呈回文序列，可以通过碱基配对自身折叠形成一个“T”型的发卡结构（T-shaped hairpin structure）。ITRs中含有AAV DNA的复制起始位点（origin），其发卡结构中折叠部分可作为自身引物促进其复制过程中第二链的合成。在ITRs序列中含有Rep蛋白结合元件（Rep binding elements，RBEs）和末端解离位点（terminal resolution site，TRS），可与复制调节蛋白Rep结合，在从AAV复制起始到形成双链的整个过程中发挥关键作用。除复制外，ITRs在AAV基因组的包装、转录、非复制允许条件下的负性调控和点特异性整合等过程中也都是必不可少的。
AAV2可以通过与宿主细胞表面受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan）结合进入细胞。此外，还有一些共受体可以增强细胞对AAV2的内摄作用。目前已知AAV2的共受体[3，4]有αVβ5整联蛋白（αVβ5 integrins）、纤维母细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1）、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor）、αvβ1整联蛋白（αvβ1 integrin）和层粘连蛋白受体（laminin receptor）等。AAV感染宿主细胞后存在两种生活周期：溶解期（lytic stage）和溶源期（lysogenic stage）。在辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）存在时，AAV进入溶解期，其基因组复制、表达并产生具有感染性的病毒颗粒。而当辅助病毒缺如时，AAV的复制和表达受到抑制，以潜伏感染的形式整合到19号染色体（q13.4）的长4.0kb的AAVS1区域中。定点整合能力是AAV独有的生物学特性，其机制与AAV基因组中的ITRs、Rep78或Rep68以及一段长138bp的整合效率元件[5]（integration efficiency element，IEE）有关。潜伏感染的野生型AAV在组织培养中不具有致病性。据统计，在人群中70%～80%的个体感染过AAV，但到目前为止临床上还没有因AAV感染而引起不良后果的报道。这是AAV的另一个独特的生物学特性。
2 AAV与阿尔茨海默病
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种发生于老年期或老年前期，以进行性认知障碍和行为损害为主的神经系统退行性疾病，是老年期痴呆的最常见类型。患者尸检显示脑组织萎缩，特别是海马和前脑基底部神经元缺失，组织病理学上的典型改变为β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积形成神经炎性斑（neuritic plaques，NPs）和神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。其发病机制尚未完全明了。
AD在临床上以脑循环改善剂（如尼莫地平、氟桂利嗪等）、亲智能药（如甲磺双氢麦角胺、胞磷胆碱等）、神经递质相关药物（如多奈哌齐、美金刚、吡拉西坦等）及对症治疗为主，疗效有限。AD的基因治疗目前多致力于保护胆碱能神经元和减少Aβ的沉积等方面。
2.1 神经生长因子策略
AD认知和记忆功能障碍的主要解剖基础是海马组织结构的萎缩，功能基础主要是胆碱能神经兴奋传递障碍和中枢神经系统内乙酰胆碱受体变性、神经元数目减少等。目前采用的比较特异性的治疗策略是保护中枢胆碱能神经功能。
经大量研究证实，在AD动物模型中，给予神经生长因子（nerve growth factor，NGF）能够保护胆碱能神经元、改善疾病所致的行为异常。与传统的胆碱能保护药胆碱酯酶抑制剂（cholinesterase inhibitors，ChEIs）相比，NGF能够：①更有效地保护基底前脑胆碱能神经元（basal forebrain cholinergic neurons，BFCNs）；②增加残余BFCNs活力；③产生更多的乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）而不具有剂量依赖性外周毒性；④能够保护和修复Ach传递的天然时空模式[6]。
对NGF的研究已有数十年的历史，其在体外及动物体内所取得的实验结果令人振奋，给AD等神经系统变性疾病的治疗带来了希望。人们试图将神经营养因子治疗策略在动物模型中取得的成功转化到临床应用上。目前，NGF已经用于糖尿病性周围神经病、HIV相关神经病和AD的临床试验中。然而，每一项临床试验的结果都令人失望，或未见疗效，或副作用明显。NGF在体内半衰期短，不能通过血脑屏障，因此，只有持续将药物直接作用于靶点才能达到治疗目的。因此，若要成功应用NGF治疗AD，必须满足以下两个条件：①能够有效作用于靶细胞并能够在靶作用点长期、稳定表达；②表达范围不能超过靶细胞以外的区域。Kathie M等提出利用AAV2携带人神经生长因子（CERE-110，AAV2-NGF），通过立体定向外科手术的给药方法作用于Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）[7]。结果表明，CERE-110可以准确在脑靶作用区域中表达；通过调整给药剂量，可以控制NGF的表达范围；NGF的表达在给药后的3、6、9和12个月时都可以在受试动物中观察到。目前，应用CERE-110治疗轻、中度AD的Ⅰ期临床试验业已开展。
2.2 疫苗治疗策略
老年斑是AD的特征性病理表现，其主要组成成分为β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）。Aβ沉积与淀粉样蛋白前体（amyloid precursor protein，APP）的变异及其转化过程发生改变有关。减少Aβ沉积亦成为目前基因治疗的主要靶点之一。
AN-1792，由Aβ42肽和QS-21佐剂构成的世界上第一个Aβ疫苗，于1999年12月进入临床试验阶段。然而，在2002年1月，由于6%的受试者出现无菌性脑膜脑炎（aseptic meningoencephalitis），以致该试验在Ⅱa期时被提前中止。尸检发现，接种者脑中的Aβ明显减少，并可检测到浸润的CD4+ T淋巴细胞。这些结果证实，疫苗启动了小胶质细胞对Aβ的清除，但也同时激活了Aβ反应性自身免疫T细胞，并使其侵入中枢神经系统，介导了脑部的炎症反应。令人欣慰的是，获得抗Aβ抗体的受试者，与未获得者比较，其认知功能减退的速度明显降低，日常生活质量显著提高。因此，Aβ疫苗依然是一种充满希望的AD治疗策略，但必须要解决其所涉及的安全性问题。为此，科研人员开发了各种各样的技术，力求在增加特异性抗体产生的同时，尽可能地减少自身免疫性T细胞毒性作用。
腺相关病毒因为其本身的低免疫源性和无致病性为Aβ疫苗的应用开拓了新的思路。Zhang等利用腺相关病毒作为载体，尝试不同的给药途径，在AD转基因小鼠体内表达CB-Aβ42（霍乱毒素B亚基和Aβ42融合蛋白）。结果证明，这种AAV-CB-Aβ42诱导产生了可长期表达的高水平的Aβ特异性抗体，提高了小鼠的记忆和认知能力，减少了脑内Aβ的积聚和相关的星形胶质细胞增生。这些实验结果证实了AAV介导Aβ疫苗的安全性和有效性，相信会给AD的疫苗治疗带来新的生机。
2.3 其他
重组腺相关病毒载体还广泛用于其他各种AD基因治疗中。如其在细胞内抗体（intracellular antibodies）、脑啡肽酶（neprilysin，NEP）、载脂蛋白E基因（ApoE）等的应用中，都取得了较为理想的前临床实验结果，这为其将来进入临床治疗打下了良好的基础。
3 展望
基因治疗已经成为目前医学研究的热点。有效的基因治疗需要解决以下3个问题：①在分子水平上阐明疾病发生的机制；②找出治疗疾病的相关基因；③应用适合的载体通过合理的方法将目的基因导入靶细胞。目前用于基因治疗的载体分为两类：非病毒载体和病毒载体。前者包括裸DNA（purified DNA）、基因枪（shotgun）和脂质体-DNA复合物（lipid-DNA complexes）等。这些非病毒载体各具特色，但其基因传递和表达效率较低，不能满足人们的需要。目前主要的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒等。每一种病毒载体都各具有其优点和缺点。其中，腺相关病毒由于具有宿主范围广、能够定点整合入人类染色体、无致病性、可以稳定和长期表达、免疫源性小等特点，日益受到科学工作者的青睐。目前，rAAV已经成功地转导了肌肉、肝、脑、视网膜和肺等组织。有关rAAV载体介导的各种临床试验也正在开展中。此外，对AAV载体本身的改造亦没有停止，一系列的努力克服了AAV自身的局限性，极大地拓宽了它的应用范围。
基因工程的研究已经有数十年的历史，但是，到目前为止，还没有哪一种载体在基因治疗中是尽善尽美的，尽管重组腺相关病毒载体在多种疾病的病因学和动物实验中都取得了可喜的进展，但是以腺相关病毒作为载体的临床试验，其结果都不能令人满意。腺相关病毒载体还存在许多问题（例如免疫反应等）限制了它更为广泛的应用。关于基因治疗，我们还有很长的路要走。重组腺相关病毒载体的进展为基因治疗的明天带来了希望，还需要广大科研工作者不断地进行更为深入的研究。
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篇11
一、 sCI基因治疗有关分子生物学基础
基因转移（ gene transrer）是实现基因治疗的关键技术［6］。因此，基因治疗的首要步骤是转导基因的分子构建。一般转导基因由目的基因 cDNA，启动子／增强子和载体三部分组成。目的基因重组时除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常还需进行必要的修饰，如转录起始修饰，翻译起始，内含子和聚腺苷酸化信号等的修饰。用于重组的启动子／增强子，一般有三种：强组成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及组织持异型启动子（ tissuesepcific），其中最常用为第一型［7］。理想的体内基因转移载体要求：转移具有细胞靶向性，导入基因的表达可调控，而且转移的方法简便易行。用于 sCI的基因转移载体主要是逆转录病毒载体（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫罗尼小鼠白血病病毒和劳斯肉瘤病毒等。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以对插入的外源基因进行有效转录，这样先在体外构建反转录病毒前病毒 dNA载体，即酶切去除基因组中的反式作用区域（ gag， polenv基因区域），产生缺陷型的反转录病毒，这种病毒只具有控制感染和整合的序列（即顺式作用区域）。缺陷型病毒载体必须依赖包装细胞提供的蛋白质才能完成包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞，载体 dNA将依靠其 lTR整合入受体细胞染色体基因组，这样外源基因被带入宿主细胞并得以表达［2、3、6、7］。逆转录病毒载体感染率高，最常用于体外间接基因治疗，其缺点是要求靶细胞必须有增殖和分裂特性［8］。此外， cao（1995）［9］等研究用阳离子脂质体直接注入 cNS作基因转移获得成功。但因阳离子脂质体对 cNS有毒性，故目前致力于发展非病毒技术，一种阳离子多聚体一聚乙烯亚胺（ polyetnyl－ enimine）业已用于基因转移［10］。另有 selle［6］（1993）等报道的复制缺陷腺病毒也是一种适用于神经系统的理想载体。
在 sCI治疗中，由于受体细胞要植入脊髓内，因此所用受体细胞应当符合一定的标准［4、6］：①容易获取和繁殖；②移植后能长期存活且能继续分裂和具有活力。③无免疫源性及形成肿瘤的危险。目前已用于 sCI试验有雪旺氏细胞（ schwann cell， sC）和成纤维细胞［2、3、11］。此外，肌母细胞也是具有应用前景的较好受体细胞，研究表明肌母细胞转移至 cNS至少可活6个月，且无肿瘤源性［12］。
基因治疗的实施，有赖于将目的基因准确、高效地转入靶细胞，并使之安全，高效和可控地表达。基因治疗中基因转移的策略主要有两种，即活体外法（ exvivo approach）和在体法（ invivo approach）。活体外法就是在体外先对适当细胞进行遗传修饰，使其表达和分泌特定的重组蛋白，然后将修饰细胞移植入活体神经组织，通过神经递质替代或神经营养因子（ neurotrophic factor， nTF）和／其它治疗因子的引入恢复正常的神经功能。这种方法尤其适于因缺乏 nTF或神经递质前体分子等可扩散物质所致的 cNS疾病。如帕金森氏病（ parkinson＇ s diesease， pD）及 cNS损伤。
在体法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体将目的基因及有治疗作用的重组蛋白直接转移，效率较低，故较少采用。此外，活体外法可采用自体的工程细胞移植，在体外可对高表达细胞克隆进行筛选，有效的控制移植细胞的数量和质量，应用立体定位和成像技术可以将工程细胞十分准确地移植到 cNS特定的区域内，以保证在局部产生高浓度的治疗因子。
二、基因治疗 sCI的现状和展望
篇12
中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1007－7847(2007)03－0273－06
人端粒酶催化亚单位(human telomerasecatalytic subunit，hTERT)是端粒酶的重要组成部分，其活性是端粒酶活性的决定性因素，几乎所有分化成熟的正常体细胞均无端粒酶表达，而85％以上的肿瘤细胞中有高水平的端粒酶活性，因此，hTERT基因的表达也具有高度的肿瘤特异性，对端粒酶的深入研究结果显示，hTERT基因表达的调节是多水平的，其中hTERT启动子在转录水平的调控是最主要的调节机制，因此，作为转录调控元件的hTERT基因启动子的转录活性也应该具有高度肿瘤特异性，基于此，如果用hTERT启动子作为基因转录调控元件，来调控治疗基因在肿瘤细胞异性表达，有可能实现肿瘤基因治疗的靶向性，这方面的初步研究结果展示了令人鼓舞的前景，本研究采用基因工程方法构建了hTERT启动子调控自杀基因HSV-TK的肿瘤细胞特异性表达载体，以探讨hTERT启动子作为肺癌靶向性基因治疗中转录调控元件的可能性。
1 材料和方法
1．1 实验材料
1．1．1 细胞
人肺腺癌细胞株A549和人胚肺成纤维细胞株MRC-5分别引自中国医学科学院上海细胞库和中国典型培养物保藏中心。
1．1．2 质粒
含SV40启动子和增强子的荧光素酶报告质粒pGL3-Control，由四川大学华西医院感染性疾病中心唐红教授惠赠：含TK基因的质粒PCDNA3-TK由四川大学华西医院车国卫博士惠赠，含1083bp的hTERT启动子的质粒pGL3-hTp由本课题组在前一阶段研究中构建。
1．1．3 主要试剂
限制性内切酶HindⅢ、Xba I、PCR试剂盒、RT-PCR试剂盒及DNA连接试剂盒DNA LigationKit Ver.2.1均为大连宝生物工程有限公司产品：脂质体Lipofectamine 2000、RNA提取试剂Trizol以及RPMI 1640、DMEM培养基均为Invitrogen公司产品；TK基因PCR引物由北京赛百盛公司合成；细胞基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒及PCR反应产物回收纯化试剂盒均购自北京赛百盛公司。
1．2 实验方法
1．2．1 PCE扩增TK基因
以质粒PCDNA3-TK为模板扩增TK基因，TK基因上游引物序列为：5'CCCAAG CTTM CGC GTATGG cTr CGT AC 3'，下游引物序列为：5'CCCTCT AGA CCG GTA TrG TCT CCT TC 3'，上下游引物5′端分别带有HindⅢ、Xba I的酶切位点(用下划线标示)；PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min，反应结束后，取PCR产物6μL电泳，并送大连宝生物工程有限公司作DNA测序。
1．2．2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重组质粒的构建及鉴定。
质粒pGL3-hTp和pGL3-control作HindⅢ/XbaI双酶切，用胶回收方法回收酶切产物中去除lu-ciferase基因片段的载体片段(分别约4.2kb和3.6Lb)，并与PCR扩增的TK基因的HindⅢ/XbaI双酶切产物作连接反应(图1，2)；反应液转化大肠杆菌JM-109，用氨苄青霉素筛选阳性菌落，扩增，提取质粒，采用单酶切(HindⅢ)、双酶切(HindⅢ/XbaI)和PCR方法鉴定。
1．2．3 转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTD-TK的细胞A549和MRC-5中TK基因表达的检测
对数生长期的A549和MRC-5细胞，用脂质体法分别瞬时转染重组质粒pGL3-SV40-TK(阳性对照组)、pGL3-hTp-TK(实验组)和pGL3-hTp(阴性对照组)，转染方法按照Lipofectamine 2000操作说明进行，72h后，提取DNA和RNA，并用PCR和R7-PCR方法检测各转染细胞中TK基因的存在和表达情况。
2 结果
2．1 TK基因的PCR产物电泳鉴定及DNA测序结果
电泳显示，TK基因长度约1.1kb(图3)；DNA测序结果与GenBank中TK基因序列完全一致(Ac- cession NP_044624)，长度为1131bp(图4)。
2．2 pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK重组质粒的鉴定
HindⅢ单酶切显示，pGL3-hTp-TK长度为5.4kb，pGL3-SV40-TK长度为4.8kb；两种质粒HindⅢ／Xba I双酶切均在1.1kb位置出现DNA条带(TK基因)，以两种重组质粒为模板，PCR均扩增出厂K基因片段(图5和图6)。
2．3 转染细胞中rx基因表达的检测结果
转染了质粒pGL3-h7p-TK和pGL3-SV40-TK的细胞株A549和MRC-5基因组DNA，PCR均扩增出TK基因(图7)，说明pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK均成功转入A549和MRC-5细胞：TK-PCR实验结果显示：转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达，转染pGL3-hTp-TK的细胞中，A549有TK mRNA表达，MRC-5无TK mRNA表达；转染pGL3-hTp的A549和MRC-5细胞均无TKmRNA表达(图8，9)。
3 讨论
自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一，自杀基因是来源于病毒或细菌的一些药物酶基因，如果将他们导人肿瘤细胞，
篇13
【关键词】 黑色素瘤;自杀基因系原/治疗应用;基因疗法;细胞培养
恶性黑色素瘤是皮肤肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，其发病率在世界范围内位居所有恶性肿瘤中第7位。致死率高的主要原因在于黑素瘤细胞本身抗凋亡能力强及生长微环境血供丰富。肿瘤的基因治疗，特别是肿瘤自杀基因治疗已经成为最具应用前景的、崭新的肿瘤综合治疗措施之一。目前已在临床病人及实验动物上广泛应用于肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、脑瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤的治疗，并已观察到较好的效果[1-2]。该方法的一个显著特点是存在旁观者效应(bystander effect)， 即加入前体药物后，不仅导入了自杀基因的细胞被杀死，邻近未导入的细胞也可被杀死[3-6]，但也存在许多不足，限制其广泛应用的关键之一是不能把目的基因导入每一个待治疗的受体细胞，体内转染率通常只有10%左右。因而增强旁杀伤效应目前已成为提高自杀基因疗效的重要策略。本实验观察了不同比例B16/tk与B16对体外和体内抑瘤效应的影响，为探讨中医药增强自杀基因疗法疗效的可能性进行前期准备工作。现报道如下。
1材料与方法
11药物及配制丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品，注射用粉针剂(批号：080801 082)，015 g/支，临用前采用注射用生理盐水15 mL溶解，浓度为10g/L。
12实验仪器与试剂细胞培养用RPMI1640粉和胰蛋白酶为Gibco公司产品，青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司出品，新生牛血清为奥地利PAA公司产品，四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均为美国Sigama公司产品，IX71F22FL/PH型荧光倒置显微镜及图像采集系统(日本Olympus)，BioRad680型全自动酶标仪(日本BioRad)等。
13细胞株小鼠黑色素瘤细胞株B16购自中山大学动物中心细胞库。病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，本课题组已构建重组PT67/tk，并将其产生的重组pLXSN/tk的逆转录病毒转染到B16细胞内并筛选到稳定整合株，记为B16/tk [7]。
14细胞培养用完全培养基(含RPMI1640培养基、体积分数10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、01 mg/mL链霉素)接种在培养瓶中，置体积分数5%CO2、37℃培养至融合率80%～90%时传代进行实验，接种细胞浓度为1×105/mL。
15动物C57BL/6J小鼠，l8～22 g，雄性，健康，SPF级，购自中山大学实验动物中心，合格证号：SQAK(粤)2004-0011。
16tk/GCV对小鼠黑色素瘤细胞株B16的体外杀伤效应B16和B16/tk(tk+)按tk+细胞占总细胞数的0、10%、20%、40%、80%、100%混合，以2×104个/mL的密度将细胞接种于96孔板，体积为每孔100 μL，培养24 h后每孔加入终浓度为157 μmol/L的丙氧鸟苷(GCV)，加入RPMI1640培养基至每孔总体积为200 μL。每组设6个复孔，培养箱中培养72 h，MTT法检测：加药培养后，吸弃每孔上清，每孔加入无血清RPMI1640细胞培养液90μL和MTT10 μL(500mg/L)，置于培养箱内培养4 h后，吸弃全部上清培养液，加入DMSO 150μL，震荡10 min，然后用酶标仪在490 nm波长下测定每孔吸光值(D)。
17小鼠移植性黑色素瘤的造模及治疗C57BL/6J雄性小鼠54只，随机分为正常对照组、模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组、80%tk/GCV组6组，每组9只。将B16/tk和野生型B16按tk+细胞占总细胞数的0、20%、40%、80%比例混合，接种前镜下观察黑色素瘤细胞形态。将混合后的小鼠黑色素瘤细胞制备成2×109个/L的细胞悬液，台盼蓝活细胞计数>90%。常规酒精消毒C57BL/6J小鼠右腋下皮肤，按01 mL/只悬液(含2×105 个肿瘤细胞)分别接种小鼠右前肢腋下组织内造模，记为模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组、80%tk/GCV组。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水01 mL/只。正常对照组和模型组第8～15天以蒸馏水腹腔注射02 mL·d-1·只-1，其他各组第8～15天腹腔注射GCV，给药剂量为100 mg·kg-1·d-1。
18观察项目
181一般状况观察小鼠活动情况、毛发、营养、肿瘤生长及死亡等情况。
182肿瘤体积在肿瘤出现后每天用游标卡尺测定肿块的长径a(cm)及与之垂直的短径b(cm)，计算肿瘤体积[8]V(cm3)=05×a×b2，根据测量的肿瘤体积绘制肿瘤生长体积曲线图。
183肿瘤质量实验结束后处死动物，仰面固定，用眼科剪分离剥取肿瘤，万分之一电子天平称质量(湿重)，记录结果。计算抑瘤率[9] ：P抑瘤(%)=(m模型组-m治疗组)/ m模型组×100%
19统计学方法采用SPSS 100统计软件包，组间比较用LSD法。肿瘤质量数据的处理是先进行数据对数转换，随后进行方差分析。
2结果
21GCV体外杀伤效应铺板后倒置显微镜下观察细胞，可见细胞均匀透亮，胞膜完整，胞体呈圆形，悬浮于培养液中;24 h后，细胞呈现贴壁状态，细胞形态为扁平的多角形，胞质均匀，胞膜完整，各组间无明显差异;48 h和72 h后，Bl6/tk的给药孔中均见细胞死亡，表现为细胞变圆，大片漂浮，胞膜不完整，并且碎裂成小粒状，tk+细胞比例越高，死亡细胞数越多。野生型B16细胞对照组及给药孔均呈现明显的细胞增殖，GCV对其无明显作用(图1)。MTT检测显示，B16对照组和0%tk/GCV组抑制率差异无显著性意义(P>005)。而B16tk/GCV各组随着tk比例的增加细胞密度逐渐降低、抑制率明显增加，但旁杀伤效应不明显(表 1)。表 1不同tk+细胞比例对tk/GCV系统杀伤B16细胞的影响
22各组小鼠一般状况、成瘤时间及成瘤率正常对照组小鼠体形正常，运动快速有力，反应灵敏，被毛浓密有光泽，黑色，紧贴身体而不粗乱蓬松。其他组小鼠随着肿瘤的增大，逐渐表现为活动迟缓，被毛无光泽，肿瘤越大表现越突出。模型组、0%tk/GCV组、20%tk/GCV组、40%tk/GCV组接种第11天后陆续可触及皮下肿瘤，成瘤率100% ，80%tk/GCV组接种第12天后陆续可触及皮下肿瘤，成瘤率111%。(注：计算成瘤率时在模型组出现首例肿瘤前死亡动物不作为总数计算)
23各组接种后不同时间肿瘤体积及肿瘤生长体积曲线随着治疗的进行，20%以上tk/GCV治疗组肿瘤呈现明显生长抑制状态(P
统计方法：t检验;①P
图2肿瘤生长体积曲线
Figure 2Tumor growth curre of different groups
24各组肿瘤质量(湿重)实验结束后处死动物，剥离肿瘤，称质量。表2结果表明药物治疗的各组肿瘤质量均较模型组轻，但只有80%tk/GCV组有明显抑瘤作用(P
25肿瘤的肉眼观察模型组和B16/GCV组肿瘤大小不一，体积较大，形状不规则，呈黑褐色，多数肿瘤切开时见肿瘤组织坏死;其他各不同比例B16tk组体积较小，形状较规则，肿瘤外周有假包膜形成，以80%tk/GCV组最明显(图 3)。
3讨论
基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法，是分子生物学技术在医学中的一项重要应用。目前较成熟的肿瘤基因治疗方案有：免疫基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因治疗、肿瘤多药耐药基因治疗、抑制血管生成的基因治疗等[10]，其中自杀基因疗法较受关注。HSVtk/GCV治疗系统为其中最常用、最重要的自杀基因系统之一。该系统的作用机制是：将HSVtk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因转入肿瘤细胞后让其表达tk(胸苷激酶)，然后加入低毒的核苷类似物GCV，GCV被tk催化生成为丙氧鸟苷一磷酸(GCVMP)，随后在细胞里原有的鸟苷酸激酶和核苷二磷酸激酶作用下生成丙氧鸟苷三磷酸(GCVTP)。GCVTP可竞争性地参与细胞DNA的生物合成，导致DNA损伤，抑制细胞分裂，引起细胞死亡。tk/GCV自杀基因系统已经被美国FDA批准进入Ⅲ期临床试验研究，被应用于脑肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的临床试验阶段。拥有我国自主知识产权的基于tk/GCV系统方案的基因治疗制剂也于2004年7月经国家食品药品监督管理局批准进行了Ⅰ期临床试验，并即将开展Ⅱ期临床试验[11-12]。
黑色素瘤是起源于神经外胚叶的恶性肿瘤。大多发生在皮肤，如躯干、头颈、手背、下肢等部位，也可发生于皮肤以外的黏膜、脑膜、虹膜、脉络膜、腮腺、呼吸道、胃肠道、阴道、心脏等。黑色素瘤常规治疗方法有：手术治疗、化疗、放疗、免疫治疗等。由于黑色素瘤的早期转移和对放疗、化疗不敏感，以及免疫治疗的毒副作用等因素，传统治疗方法未能获得满意的疗效[13]。因而，黑色素瘤成为基因治疗研究的主要对象之一[14-16]。
本研究体外实验结果显示，已构建的tk/GCV系统能有效杀伤小鼠黑色素瘤细胞，20% tk+细胞比例可使抑制率达到 211%，但旁杀伤效应不明显。体内抑瘤实验显示，随着tk+细胞比例的增加，抑瘤率也随之升高，80% tk+/GCV组和其他各组比较差异均有显著性意义(P
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